長鏈非編碼RNA HOTAIR 在結直腸癌中的表達、臨床意義及預后分析

武雪亮 楊東東 王立坤 何琨

河北北方學院附屬第一醫院1普通外科，2超聲醫學科，3老干部科（河北張家口075000）

據最新流行病學調查顯示，2014年我國居民結直腸癌發病例數位居第三位，嚴重威脅國民健康［1］。結直腸癌的早期診斷及規范治療，對患者生存時間，生存質量有著重要影響。從分子生物學水平，尋找敏感度高、特異性強的標記物已成為結直腸癌早期診斷的研究熱點，同時為腫瘤的放化療、靶向治療提供新的技術支撐。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是近年來腫瘤發病機制研究領域的一個新的方向［2］，lncRNA 系無蛋白質編碼產物，卻廣泛參與細胞的生理、病理學過程，包括細胞周期、凋亡和信號通路的調控，其失調表現在乳腺癌、胃癌、胰腺癌等人類許多諸多惡性腫瘤中［3-5］。HOX 轉錄反義RNA（HOX transcript anti-sense RNA，HOTAIR）是首個被發現以反式轉錄方式調控基因表達的lncRNA［6］，研究證實［7-9］HOTAIR 的沉默與乳腺癌、肺癌、腺癌等人類多個腫瘤的惡性生物學行為關系密切，且抑制腫瘤中HOTAIR 的表達能有效抑制上述腫瘤細胞的生長與侵襲能力，因而成為腫瘤致癌機制及靶向研究領域一個新的研究熱點。但目前，HOTAIR 在結直腸癌方面的研究較少，相關的作用機制和通路尚不明確。本研究通過檢測HOTAIR 在結直腸癌中的表達情況，分析其與相關臨床病理因素間的關系，結合生存時間的隨訪，以期為結直腸癌的早期診斷、治療和預后監測提供準確、可靠的生物學指標。

1 資料與方法

1.1 病例資料本次實驗對象為2012年1月至2014年1月間河北北方學院附屬第一醫院病理確診結直腸癌組織和癌旁正常組織標本各90 例，同時收集患者完整的臨床資料。

1.2 主要試劑與實驗方法

1.2.1 主要試劑和儀器RNA 逆轉錄試劑購自Takara 公司；SYBR Green 實時定量PCR 試劑盒購自美國伯樂公司；HOTAIR 和GAPDH 引物由生工生物（北京）有限公司設計合成，全自動電化學發光免疫分析儀購自瑞士羅氏公司E2010。

1.2.2 RT-PCR法檢測HOTAIR mRNA表達提取總RNA 并定量，反轉錄為cDNA。lincRNA HOTAIR引物，上游5′-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3′，下游5′-GTGCCTGGTGCTCTCTTACC-3′；GAPDH 引物，上游5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′，下游5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。

PCR 反應試劑：SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus），TaKaRa Code：DRR420A 取1 μL 逆 轉錄的cDNA 模板，加入10 μL 的2×PrimeSTAR Max Premix，0.4 μL 的sense primer，0.4 μL 的anti-sense primer，加滅菌蒸餾水至20 μL。輕柔混勻，離心。PCR 反應體系，95 ℃9 呼育30 s；95 ℃孵育5 s，60 ℃孵育20 s，共反應進行40 個循環；然后72 ℃孵育20 s，95 ℃孵育15 s 終止反應。熒光定量PCR實驗數據處理使用2-△△Ct法，其中，中位數以上為高表達，以下則考慮低表達。

1.2.3 隨訪通過門診復查、電話隨訪，時間為2018年10月30日。

1.3 統計學方法應用SPSS 17.0 軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用t 檢驗，計數資料以百分率表示，兩組比較運用χ2檢驗，多組比較應用方差分析，用GraphPad Prism 6 軟件繪制統計圖，應用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，通過Cox 回歸模型分析結直腸癌患者預后的獨立影響因素，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RT-PCR 檢測HOTAIR mRNA 的表達以HOTAIR/GAPDH 比值作為RT-PCR 定量分析，癌組織中HOTAIR mRNA 的表達水平（0.86 ± 0.05）明顯高于結直腸正常組織（0.17±0.02），差異有統計學意義（P=0.003，圖1）。

2.2 HOTAIR 表達與結直腸癌臨床病理特征的關系HOTAIR 的表達均與腫瘤的浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移、肝轉移及脈管浸潤有相關性（均P ＜0.05）。TNM 分期高、分化越低，HOTAIR的表達水平越高（均P ＜0.05）；伴淋巴結轉移、肝轉移、脈管和神經浸潤的患者HOTAIR 的表達水平明顯高于未轉移和非浸潤的患者（均P ＜0.05）；而HOTAIR 的表達水平與患者腫瘤大小、病理類型、病變部位、腫瘤形態均無相關性（均P ＞0.05）。見表1。

2.3 HOTAIR 表達與結直腸癌患者生存的相關性隨訪結果顯示，截止到2018年10月30日，共有48 例患者死亡，生存率為46.66%，其中死亡患者HOTAIR 表達水平為（0.880 ± 0.105），明顯高于生存患者的（0.662 ± 0.113），差異有統計學意義（P = 0.002）；HOTAIR 高表達58 例，20 例生存，38例死亡，中位生存時間為23 個月，HOTAIR 低表達32 例，22 例生存，10 例死亡，中位生存時間為35個月。Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，Log-rank 單變量分析顯示，HOTAIR 高表達和低表達患者的生存函數比較差異有統計學意義（χ2= 7.059，P =0.011），即HOTAIR表達水平和患者生存時間相關，HOTAIR陽性患者預后更差，見圖2。

2.4 Cox 回歸模型分析HOTAIR 表達水平（95%CI：1.307 ～2.912，P=0.001）、淋巴結轉移（95%CI：1.041 ～1.620，P ＜0.001）、分化程度（95%CI：1.725～2.363，P = 0.035）等均是影響結直腸癌患者預后的獨立因素。

圖1 結直腸癌組織與正常組織lncRNA HOTAIR mRNA 相對表達量Fig.1 The relative expression of lncRNA HOTAIR mRNA in colorectal cancer tissues and normal tissues

圖2 生存曲線Fig.2 Suvival cure

3 討論

人類HOTAIR 基因位于染色體12q13 區域，HOXC11 和HOXC12 編碼區之間，由1 個長外顯子和5 個短外顯子組成。美國斯坦福大學RINN 等［6］研究證實HOTAIR 主要通過結合一系列復雜蛋白復合體從而調控下游靶致癌基因和抑癌基因的轉錄和相應蛋白的表達，其中，HOTAIR 5‘結構域結合RbAp48、EZH2、EED 和SUZ12 共同組成的多梳蛋白抑制復合物PRC2，反式作用于靶基因H3 組蛋白27 位賴氨酸的三甲基化（H3K27me3），從而抑制下游抑癌相關靶基因的轉錄；另一方面，HOTAIR 3′結構域主要通過結合賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（LSD1）/CoREST/REST 復合物，誘導H3 組蛋白4 位賴氨酸的去基化，從而調控相關靶基因的表達［10-11］。

表1 結直腸癌組織中lincRNA HOTAIR mRNA 的表達及與相臨床病理參數的關系Tab.1 The relation of lincRNA HOTAIR mRNA expression and the clinical pathological parameters in the colorectal tissues ±s

表1 結直腸癌組織中lincRNA HOTAIR mRNA 的表達及與相臨床病理參數的關系Tab.1 The relation of lincRNA HOTAIR mRNA expression and the clinical pathological parameters in the colorectal tissues ±s

臨床病例特征病理類型管狀腺癌絨毛狀腺癌乳頭狀癌病變部位直腸左半結腸右半結腸分化類型高分化中分化低分化腫瘤大小＜5 cm≥5 cm腫瘤形態潰瘍型隆起型浸潤型淋巴結轉移例數HOTAIR 表達 χ2/F 值1.905 P 值0.371 24 26 40 0.819±0.173 0.802±0.166 0.820±0.170 1.858 0.382 52 17 21 0.811±0.131 0.802±0.157 0.809±0.161 3.235 0.039 30 36 24 0.665±0.142 0.768±0.175 0.849±0.216 0.800 0.427 52 38 0.825±0.163 0.807±0.158 2.507 0.286 38 46 6 0.810±0.154 0.822±0.147 0.815±0.150 5.335＜0.001有 無56 34 0.885±0.122 0.622±0.181 TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期Ⅲ-Ⅳ期肝轉移5.179＜0.001 24 66 0.680±0.187 0.876±0.145 6.159＜0.001有 無11 79 0.905±0.113 0.602±0.172脈管浸潤4.975＜0.001有 無26 64 0.881±0.109 0.652±0.116神經浸潤6.007＜0.001有無30 60 0.892±0.107 0.605±0.113

GUPTA 等［12］發現HOTMR 在乳腺癌原發灶和轉移灶組織標本中的表達均升高，轉移灶中HOTAIR 的表達水平高出正常上皮組織含量的200～2 000 倍，因而證實HOTAIR 的表達水平對乳腺癌的早診和監測具有重要意義，同時，高表達HOTAIR 的腫瘤患者預后極差。KATAYAMA 等［13］研究證實HOTAIR 在腎細胞癌的發生過程中發揮重要作用，其通過調節胰島素生長因子結合蛋白2（IGFBP2）表達增強腎癌細胞遷移，HOTAIR 與核分裂，淋巴結轉移，和肺轉移顯著相關；LOEWEN等［14］研究證實HOTAIR 的表達在肺癌中升高并且與轉移和不良預后相關，同時HOTAIR 能促進肺癌細胞的增殖，存活，侵襲，轉移并增強其耐藥性。SVOBODA 等［15］證實結直腸癌患者血清學HOTAIR 水平明顯高于健康人群，且血清學HOTAIR 水平升高是結直腸癌患者預后的不良因素，HOTAIR 血液水平可能成為散發性結直腸癌潛在的替代預后指標。但截止目前，仍未有確切研究證實HOTAIR 在結直腸癌中的表達特性及其與癌細胞增殖、耐藥、浸潤和轉移的關系。

本研究從基因水平證實了在結直腸癌細胞中HOTAIR mRNA 水平明顯高于正常腸黏膜細胞，HOTAIR 表達水平與結直腸腫瘤的分化程度、浸潤深度、TNM 分期、轉移情況均密切相關，表明HOTAIR 表達的異常，打破了致癌基因和抑癌基因的平衡，激活了腫瘤細胞的活性并促進其侵襲增殖，從而加速腫瘤細胞的擴散和轉移。LIN 等［16］應用逆轉錄定量聚合酶鏈式反應和Western 印跡法證實HOTAIR 在結直腸癌組織中呈高表達，且與淋巴結轉移，腫瘤轉移，Dukes 分期，遠處轉移，組織學類型和分化程度明顯相關，與本研究結果一致。

本研究進一步通過隨訪證實，死亡患者HOTAIR 的表達水平明顯高于生存患者，且HOTAIR 高表達患者生存期明顯長于低表達者，差異明顯，因而HOTAIR 的表達水平可作為結直腸癌患者的重要的預后監測指標，同時Cox 回歸模型分析亦證實HOTAIR 表達水平是影響結直腸癌患者預后的獨立因素。

綜上，HOTAIR 表達的異常增高參與了結直腸癌的發生和進展過程，深入探究其致癌機制和臨床耐藥性的相關性有望為結直腸癌精確診療提供重要的理論依據，這也將是本課題下一步的研究方向。