NMDA 受體在抗NMDA 受體腦炎患者卵巢畸胎瘤組織中的表達特點及意義

王觀鳳 鄭麗嬌 黃潔 彭冬先

南方醫科大學珠江醫院婦產科（廣州510220）

抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體腦炎是一種自身免疫相關的邊緣葉副腫瘤性腦炎，是目前最常見的腦炎類型之一。抗NMDA受體腦炎最早于2007年由DALMAU 等［1］首次診斷，至今仍無統一的診斷標準，目前臨床主要在排除其他類型腦炎的基礎上根據患者臨床癥狀以及腦脊液和（或）血清中抗NMDA 受體抗體的發現進行臨床確診［2-3］。該腦炎病因不明確，可能與腫瘤、中樞神經系統感染、脫髓鞘性疾病、內分泌因素、性別、基因遺傳因素等相關。其中，有多項研究發現女性抗NMDA 受體腦炎與卵巢畸胎瘤相關性大［4-5］，然而，卵巢畸胎瘤與抗NMDA 受體腦炎的發生機制目前仍是未完全明確的。對此，國內外學者認為其最可能的發病機制是卵巢畸胎瘤中神經組織異位表達NMDA 受體，刺激機體產生抗NMDA 受體抗體，最終導致抗NMDA 受體腦炎的發生。然而卵巢畸胎瘤作為一種女性常見卵巢腫瘤，其并發抗NMDA受體腦炎者卻十分罕見，且部分卵巢畸胎瘤組織中并未含有神經組織。此外，正常情況下，NMDA受體大量表達于中樞神經系統細胞膜表面［6］，發揮細胞信號傳遞、突觸重塑等作用，其在卵巢畸胎瘤組織中的表達及作用均不明確。總體而言，目前抗NMDA 受體腦炎的發生與卵巢畸胎瘤的存在尚缺乏明確的定論，有關于巢畸胎瘤組織中NMDA受體表達情況的研究更是少見。因此，本研究擬采用免疫組織化學方法檢測抗NMDA 受體在合并抗NMDA 受體腦炎患者的卵巢畸胎瘤組織中的表達情況，研究卵巢畸胎瘤組織中NMDA 受體的表達特點及其與抗NMDA 受體腦炎的發病關系，進一步驗證抗NMDA 受體腦炎與卵巢畸胎瘤兩者的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2014年7月至2018年7月期間，在南方醫科大學珠江醫院治療的具有完整臨床病理及隨訪資料的抗NMDA 受體腦炎合并卵巢畸胎瘤患者病例。明確診斷抗NMDA 受體腦炎，同時合并卵巢畸胎瘤并行卵巢畸胎瘤切除手術。共8 例患者符合標準。對照組選取同期我院不伴有抗NMDA 受體腦炎的單純卵巢畸胎瘤組織40 例（含有神經組織者20 例、不含神經組織者20 例）及正常卵巢組織20 例（來源于子宮肌瘤或腺肌瘤手術切除的卵巢）。各組臨床資料具有可比性。分組情況：A 組：腦炎組卵巢畸胎瘤組織；B 組：非腦炎組畸胎瘤組織（含神經組織）；C 組：非腦炎組畸胎瘤組織（不含神經組織）；D 組：正常卵巢組織。

1.2 實驗試劑與方法

1.2.1 實驗試劑兔抗人NMDAR 多克隆抗體（一抗）購自美國Affinity Biosciences 公司（親和生物公司），羊抗兔IgG 抗體（二抗）、即用型SP 試劑盒、DAB 顯色試劑盒、PBS 液等均購自上海然泰生物科技有限公司。

1.2.2 實驗方法采用免疫組織化學染色法。所有標本經10%福爾馬林浸泡固定，石蠟包埋組織，4 μm 厚連續切片，進一步免疫組織化學染色和HE染色。NMDAR多克隆抗體工作液濃度為1∶100，按照試劑盒說明書進行免疫組化染色，用已知陽性片作為對照，以PBS液染色結果作陰性對照。

1.3 結果判定采取人工計數分析的方法統計分析免疫組化結果，以細胞膜及細胞漿出現紅棕色顆粒為NMDA 受體陽性染色。每張切片隨機觀察5 個高倍視野（× 400），每個視野觀察100 個細胞。匯總切片中陽性細胞占所觀察細胞總數的百分比及陽性細胞著色強度兩項指標情況，半定量判斷結果。根據顯色程度判斷陽性強度：無特異性著色0 分，淺棕色1 分，棕黃色2 分，深紅棕色3 分。染色陽性細胞所占比例按下列標準評定：陽性細胞≤10%為0 分，11%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，＞75%為4 分。兩種評分方法得分相乘作為結果判斷標準：0～1 分（-），2 分（+），3～4 分（++），5 分以上（+++），積分＜2為陰性，≥2 為陽性，≥5 分為強陽性。結果判定由兩位病理科醫師按照雙盲、獨立的原則進行。

1.4 統計學方法采用SPSS 21.0統計軟件。計數資料以例數百分比表示，計數資料比較采用Fisher精確概率檢驗法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NMDA 受體在卵巢畸胎瘤組織中表達的一般特點（圖1）NMDA 受體在卵巢畸胎瘤組織上的陽性表達為細胞膜及細胞漿呈現紅棕色染色，染色程度越深提示該受體表達量越大。該受體大部分集中表達于卵巢畸胎瘤組織中的鱗狀上皮組織，少部分位于腺上皮組織中，其中基底層組織表達量最高。此外，各組卵巢畸胎瘤組織中神經組織及正常卵巢組織均未見明顯NMDA 受體陽性表達。

2.2 NMDA受體在不同卵巢組織中的表達差異NMDA 受體在腦炎組卵巢畸胎瘤組織陽性表達率為87.5%（7/8），強陽性率為50%；在非腦炎組卵巢畸胎瘤組織（含神經組織）中的陽性表達率為60.0%（12/20），強陽性率為5%；在非腦炎組卵巢畸胎瘤組織（不含神經組織）中的陽性率為55.0%（11/20），強陽性率為5%；在正常卵巢組織中無表達。見表1、圖1。4 組卵巢組織中NMDA 受體表達的比較，經Fisher′精確概率法計算P = 0.001（P＜0.05），差異有統計學意義。

3 討論

抗NMDA 受體腦炎是近年來發現的一種新型邊緣葉副腫瘤性腦炎，是目前最常見的腦炎類型之一。2007年DALMAU 等［1］在一組合并有卵巢良性畸胎瘤的年輕女性腦炎患者體內發現了抗NMDA 抗體，并提出了抗NMDA 受體腦炎的疾病診斷。該腦炎是一種亞急性起病的炎癥性腦病，多表現為短時記憶喪失、癲癇、精神障礙等，嚴重可導致昏迷、中樞性呼吸衰竭等，多累及邊緣系統［7］。目前國內外關于該腦炎相關的研究日漸增多，但其發病機制仍未完全明確，可能的原因包括腫瘤、中樞神經系統感染、脫髓鞘性疾病、內分泌因素、性別、基因遺傳因素等。目前普遍認為抗NMDA 受體腦炎是一種抗NMDA 受體抗體免疫介導而產生神經精神系統癥狀的自身免疫性腦炎，抗NMDA 受體抗體的產生及其與NMDA 受體復合物的抗原抗體反應是該腦炎的病理基礎。

表1 NMDA 受體在不同卵巢組織中的表達情況（人工計數法）Tab.1 Expression of NMDA receptors in different ovarian tissues（Manual Counting）

圖1 NMDA 受體在不同卵巢組織中的表達情況（SP×400）Fig.1 Expression of NMDA receptors in different ovarian tissues（SP×400）

NMDA 受體復合物是一種配體門控離子通道受體，廣泛分布于中樞神經系統，尤其是海馬及大腦皮層［6］。該復合物由多種亞基及亞型組成，包括NR1、NR2A-D 和NR3A-B 等，可提供諸多配體的結合位點，具有細胞內信號傳遞、興奮性神經遞質、突觸傳遞、突觸可塑等作用。在不同的神經精神疾病中，NMDA 受體復合物的功能狀態不同［8］。在癲癇、腦卒中、老年癡呆、帕金森病等疾病中，NMDA 受體復合物多處于過度激活狀態；而在精神分裂癥中，NMDA 受體復合物的功能則處于抑制狀態。抗NMDA 受體腦炎的主要致病原因就在于中樞神經系統中抗NMDA 受體抗體免疫介導引起的NMDA 受體復合物的減少及功能抑制，NMDA受體復合物進行性缺失可能是該腦炎患者疾病進展的重要原因。

目前，多數研究結果提示女性抗NMDA 受體腦炎與卵巢畸胎瘤有關［4-5］。普遍認可的發病機制是卵巢畸胎瘤中的神經組織異位過表達NMDA受體，刺激機體產生抗NMDA 受體抗體，在適宜的條件下作用于神經系統NMDA 受體復合物，導致中樞神經系統中NMDA 受體的進行性缺失，從而引起相應的神經精神癥狀。2008年DALMAU 等［9］用患者自身抗體和NR2B 或NR2A 特異性抗體對5 例抗NMDA 受體腦炎患者的畸胎瘤組織免疫組化染色，結果發現其與神經組織的部位一致。隨后SEKI 等［10］實驗得到了相似的結果。這兩個實驗均表明卵巢畸胎瘤可表達NMDA 受體，并可能參與了抗NMDA 受體腦炎的發生發展。本研究免疫組織化學方法結果發現腦炎組及非腦炎組卵巢畸胎瘤組織均可見NMDA 受體陽性表達，其中NMDA 受體在腦炎組卵巢畸胎瘤組織中的陽性表達率達87.5%，明顯高于其在非腦炎組卵巢畸胎瘤（60.0%）及正常卵巢組織中（0%）的表達。該結果側面驗證了NMDA 受體腦炎與卵巢畸胎瘤的密切相關，這與國內外大部分文獻報道結果一致。然而也進一步提示了，卵巢畸胎瘤組織中高表達的NMDA 受體可能參與了抗NMDA 受體腦炎的發生，單純畸胎瘤的存在或者其中NMDA 受體的陽性表達均不一定導致抗NMDA 受體腦炎的發生。

與TABATA 等［11］、CLARK 等［12］研究結果一樣，本研究腦炎組及非腦炎組卵巢畸胎瘤中均可見NMDA 受體陽性表達，可見卵巢畸胎瘤的存在及其中抗NMDA 受體的存在并非抗NMDA 受體腦炎發病的單一致病因素。國外大部分研究發現卵巢畸胎瘤組織中NMDA 受體陽性染色多位于神經組織中［9-10］，認為卵巢畸胎瘤中神經組織是主要的抗原提呈部位。TABATA 等［11］、DABNER 等［13］發現合并抗NMDA 受體腦炎的卵巢畸胎瘤存在較顯著的瘤內淋巴細胞浸潤，同樣主要位于成熟的神經組織中。此外，2014年CLARK 等［12］研究結果發現單純畸胎瘤組織及合并抗NMDA 受體腦炎卵巢畸胎瘤的中鱗狀上皮組織均可表達大量的NMDA 受體。本研究中，腦炎組及非腦炎組所有卵巢畸胎瘤組織的鱗狀上皮組織均可見NMDA 受體陽性表達，且基底層細胞NMDA 受體表達量最高。另外，本研究兩組畸胎瘤組織中的神經組織成分均未見明確的NMDA 受體陽性表達，且并無特異性淋巴細胞浸潤表現，這與國外大多數文獻結果有所不同，與CLARK 等［12］研究結果一致。本研究結果提示，或者卵巢畸胎瘤組織中的鱗狀上皮組織才是真正產生NMDA 受體并最終導致抗NMDA 受體腦炎發生的主要部位。由于本研究例數較少，且尚缺乏鱗狀上皮組織及神經組織表達情況的對比，鱗狀上皮組織是否是真正的抗原提呈部位，尚需進一步的深入研究。大部分文獻［9］均提示抗NMDA 受體腦炎患者中，合并卵巢畸胎瘤者預后好，復發率低，大部分患者在切除卵巢畸胎瘤后腦炎癥狀可見明顯的好轉［10，14］。此外，國內外均可見隱匿性卵巢畸胎瘤切除術后抗NMDA 受體腦炎病情好轉的報道［15］。本研究中8 例患者在行卵巢畸胎瘤切除后病情均有明顯改善，恢復快，預后良好。本研究結果在探討畸胎瘤組織中NMDA 受體表達與抗NMDA 受體腦炎的關系上，進一步驗證了卵巢畸胎瘤與該腦炎的相關性。進一步肯定了抗NMDA 受體腦炎手術探查卵巢畸胎瘤的意義，尤其是單純內科免疫治療效果不理想的情況下。

綜上所述，抗NMDA 受體腦炎病因復雜，發病機制不明確。女性抗NMDA 受體腦炎與卵巢畸胎瘤密切相關，卵巢畸胎瘤組織NMDA 受體高表達可能是卵巢畸胎瘤引起該腦炎的發病機制。臨床上可疑或明確抗NMDA 受體腦炎患者，需盡快完善婦科卵巢腫瘤檢查，發現卵巢畸胎瘤者建議手術切除腫瘤。此外，哪些卵巢畸胎瘤患者未來發生抗NMDA 受體腦炎的風險高，檢測卵巢畸胎瘤組織中NMDA 受體表達情況或有一定的識別及預測作用。