C-erbB-2 與KRAS 基因在結直腸癌中的表達及其相互關系

潘理會 李育莊 李春輝

1承德醫學院血流變研究室（河北承德067000）；承德醫學院附屬醫院2神經內科，3病理科（河北承德067000）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發生、發展與多種基因突變及其所構成的細胞信號傳導的調控異常有關，其中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）介導的RAS/RAF/MAPK 信號傳導通路在腫瘤的發生、發展中發揮著重要作用［1］。表皮生長因子受體-2（C-erbB-2）與EGFR 同源，二者具有高度相似的生物學特性；KRAS 是RAS 基因家族中與人類腫瘤關系最為密切的一種表現形式，為C-erbB-2 信號通路下游的重要效應分子。目前，有關處在同一信號通路上的C-erbB-2與KRAS 在腫瘤中的表達及與其與腫瘤生物學行為的關系倍受關注，本研究分別采用FISH 法和實時熒光定量-PCR 法檢測CRC 組織中C-erbB-2 基因的擴增和KRAS 基因的突變，為判斷患者預后及靶向治療的潛在靶點提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2012年12月至2016年10月間承德醫學院附屬醫院行結直腸癌根治術并經病理證實的CRC 蠟塊標本共238 例（所選取標本術前均未經任何放化療治療且均具備完整病理資料）。在238例CRC 中，男124例，女114例；≤58歲89 例，＞58 歲149 例（中位年齡58 歲）；右半結腸癌39 例，左半結腸癌52 例，直腸癌147 例；非黏液腺癌201 例，黏液腺癌37 例；高分化52 例，中分化154 例，低分化32 例；有淋巴結轉移175 例，無淋巴結轉移63 例；Duke′s 分期A 期47 例，B 期82 例，C期71 例，D 期38 例；浸潤黏膜層及黏膜下層17 例，浸潤肌層74 例，浸潤漿膜層147 例。

1.2 實驗方法

1.2.1 FISH 檢測法切取石蠟切片3 μm 厚，置硅烷玻片上65 ℃過夜，常規脫蠟至水化；50 ℃下30%酸性亞硫酸鈉處理切片30 min；200 μg/mL 蛋白酶K 37 ℃消化30 min；-20 ℃預冷的70%、85%、100%乙醇梯度脫水2 min，再丙酮浸泡脫脂2 min；探針混合液73 ℃預熱5 min 滴加10 μL 于玻片上42 ℃雜交過夜，甲酰胺洗滌，自然干燥；滴加15 μL DAPI 復染，靜置20 min，熒光鏡檢。

1.2.2 FISH 結果判斷標準癌細胞核呈藍色熒光信號，C-erbB-2 基因位于核內，呈紅色熒光信號；17 號染色體著絲粒位于核內，呈綠色熒光信號。隨機計數30 個腫瘤細胞，計算紅綠比值。比值≥2.2 判斷為（＋），即C-erbB-2 基因擴增；比值＜1.8判斷為（－），即C-erbB-2 基因未擴增，比值介于1.8 ～2.2 之間，則選擇增加計數細胞數目或重做實驗來確定判最終結果。

1.2.3 實時熒光定量PCR切取石蠟切片10 μm厚5 片，常規脫蠟水化，1 張用于HE 染色鏡下觀察形態，其余用于DNA 提取，顯微鏡下觀察HE 切片選取腫瘤成分超過70%區域刮入裂解液，充分混均；1 300 r/min離心10 min，吸取上清。紫外分光光度計測量DNA 質量和濃度。從試劑盒中取出陽性質控品和Tag 酶室溫融化，混均后2 000 r/min 離心15 s；分別向45 μL待測樣品DNA（濃度約2 ng/μL）、陽性對照、陰性對照（NTC）中加入2.25 μL Tag 酶，混均后2 000 r/min 離心15 s，放在PCR 管架上，輕輕揭開反應條管蓋，將混好的DNA 樣品依次取5 μL 加入PCR 反應條中，蓋緊管蓋，移至PCR 儀檢測。反應循環參數為：預變性95 ℃5 min，1 個循環；95 ℃25 s、64 ℃20 s、72 ℃20 s，15 個循環；93 ℃25 s、60 ℃35 s、72 ℃20 s，31 個循環。反應體系為25 μL。在第3 階段60 ℃時收集信號，保存文件。

1.2.4 實時熒光定量PCR 結果判斷標準以無模板對照擴增曲線的最高點為準設定閾值。沒出現擴增曲線或Ct 值為0 的標本為（-）；出現擴增曲線且Ct ≤26.0 的標本為（+）；26.0 ≤Ct ≤28.0 的標本為可疑陽性，需重復檢測。

1.3 試劑與儀器石蠟組織DNA 提取試劑盒及C-erbB-2 基因擴增檢測試劑盒與KRAS 12、13 密碼子基因突變檢測試劑盒由福建廈門艾德生物醫藥科技有限公司生產。Mx3000P 實時熒光定量PCR儀為美國Stratagene 公司產品。

1.4 統計學方法使用SPSS 16.0 統計學軟件進行數據處理，組間比較應用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CRC 中C-erbB-2 擴增及與病理特征的關系238 例CRC 中有4 例發生C-erbB-2 擴增，總擴增率為1.7%（4/238）。C-erbB-2 擴增與年齡、性別、腫瘤位置、組織學分類、分化程度、淋巴結轉、Duke′s 分期及浸潤深度等病理參數，組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1 和圖1、2。

圖1 CRC 組織中C-erbB-2 FISH 檢測發生擴增Fig.1 Amplification of C-erbB-2 in FISH of colorectal cancer

圖2 CRC 組織中C-erbB-2 FISH 檢測未發生擴增Fig.2 Non amplification of C-erbB-2 in FISH of colorectal cancer

表1 CRC 中C-erbB-2 擴增及KRAS 突變與病理參數的關系Tab.1 C-erbB-2 amplification in the colorectal cancer and the relationship between the KRAS mutations and pathological characteristics

2.2 CRC 中KRAS 突變及與病理參數的關系238 例CRC 中有88 例發生KRAS 突變（圖3），總突變率為32.3%（88/238）。KRAS 突變與淋巴結轉移和Duke′s 分期明顯相關，在淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組突變率分別為47.4%（83/175）、36.5%（23/63）（P = 0.043），組間差異有統計學意義；在Duke′s 分期A、B、C、D 期突變率分別為23.4%（11/47）、31.7%（26/82）、42.3%（30/71）、50.0%（19/38）（P = 0.019），組間差異有統計學意義；與其他臨床病理特征比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

圖3 KRAS 基因突變圖Fig.3 The amplification plots of KRAS gene mutation

2.3 CRC 中C-erbB-2 擴增與KRAS 突變間的相關性相關分析顯示，C-erbB-2 擴增與KRAS 突變沒有相關關系（P = 0.076，表2），但238 例CRC 中有4 例C-erbB-2 擴增，在4 例C-erbB-2 擴增中有1例KRAS 突變，3 例未發生突變，二者突變重疊率為25%，在234 例C-erbB-2 擴增中有85 例KRAS 突變，149 例未發生突變，二者重疊比例為57%，可見，二者存在正相關關系。

表2 CRC 中C-erbB-2 擴增與KRAS 突變的相關性Tab.2 The amplification of C-erbB-2 and the mutations value of KRAS in colorectal cancer

3 討論

原癌基因C-erbB-2 它定位于17 號染色體q11-21 上，其結構同EGFR 蛋白的氨基酸排列順序具有50%左右的同源性，因此C-erbB-2 與EGFR 二者具有相同的蛋白激酶活性，并在控制細胞得分裂及分化中起著非常重要的作用；KRAS 基因當其發生異常改變時，則導致細胞的過度持續生長，并且能阻止細胞自我毀滅的發生，由于細胞內的信號通路的改變，當KRAS 基因發生突變時，該基因就發生了永久活化，進而導致細胞內信號傳導的改變，使細胞過度增殖、失控而導致癌的發生。C-erbB-2 是一種細胞來源的原癌基因是EGFR 家族成員之一，其激活后可通過不同信號轉導通路參與對細胞的生長、增殖、分裂及凋亡的調控［1-2］，有學者研究證實C-erbB-2 基因的擴增程度在CRC中比正常大腸黏膜高，并且C-erbB-2 基因的擴增程度在CRC 中隨著CRC 組織學分級程度的加重C-erbB-2 基因擴增也逐漸的向高拷貝轉移，組織學分級越低的CRC，C-erbB-2 基因擴增越強，由此說明C-erbB-2 基因的擴增可以在一定程度上反映著CRC 的惡性轉化以及其生物學的行為，也就是說CRC 的惡性轉化以及其生物學的行為有賴于C-erbB-2 基因的活化［1，3］，另外，也有學者研究證實，CRC 患者C-erbB-2 基因的擴增在有淋巴結轉移者明顯強于無淋巴結轉移者，也就是說CRC 淋巴結轉移與C-erbB-2 基因擴增有密切關系，CRC中C-erbB-2 基因擴增使CRC 侵襲、轉移的能力增強，提示CRC 患者預后不良，這也揭示了C-erbB-2基因的擴增有可能成為CRC 患者預后參考指標，具有重要的理論意義和實際意義［4-6］。本研究的結果顯示C-erbB-2 基因的擴增與CRC 患者的性別、年齡、CRC 的部位、CRC 分期、CRC 分化程度、CRC 組織學類型、是否有淋巴結轉移以及Duke′s分期無關，這個結果提示C-erbB-2 基因的擴增未參與CRC 的分化及侵襲轉移，與患者的預后無關，導致上述結果的原因可能是C-erbB-2 基因的擴增對CRC 預后的影響較弱，并且CRC 本身預后較差，使C-erbB-2 基因的擴增對CRC 預后影響表現的不夠穩定，得出這樣的結果，因此如果C-erbB-2 基因發生擴增，那么患者就可用靶向藥進行分子靶向治療，表明C-erbB-2 基因的擴增是應用分子靶向治療的主要依據，C-erbB-2 基因的擴增不能作為分子靶向治療獨立的指標，同時C-erbB-2 基因的擴增也不能作為判斷CRC 的預后的單一指標，與腫瘤發生有關的RAS 基因家族成員有3 種，即分別定位在11、12 和1 號染色體上的HRAS、KRAS、NRAS 基因，KRAS 基因又稱p21 基因，其是編碼為21 kD 的RAS 蛋白。在RAS 基因家族中，KRAS 基因與人類癌癥的發生、發展關系最為密切，它就如一個分子開關：當其在正常生理狀態時可調控細胞生長的傳導路徑；當其發生異常改變時，則導致細胞的過度持續生長，并且能阻止細胞自我毀滅的發生，由于細胞內的信號通路的改變KRAS 基因可以是野生型或突變型，在正常生理情況下，細胞受到外界刺激后激活EGFR 等信號通路，野生型KRAS 被活性的EGFR 短暫活化，活化的KRAS 激活該信號傳導通路中的下游信號組件蛋白，使KRAS 迅速的失活，在正常情況下KRAS 激活或失活效應是受控的。KRAS 突變型蛋白可導致蛋白功能異常，在無EGFR 活化信號刺激的情況下仍處于激活狀態，那么它的功能狀態則不可控，就導致腫瘤的持續增殖，繼而導致腫瘤的發生、發展，KRAS 是RAS 家族成員之一，參與C-erbB-2 信號通路的傳導，KRAS 基因是最常見的突變基因之一［7-13］，KRAS 基因突變與腫瘤生物學行為的關系，各家報道眾說不一，分歧較大。王璇等［14］報道CRC 中KRAS 突變率為38.8%，與性別及淋巴結轉移有關。MANNAN 等［15］報道CRC 中KRAS 突變率高達50%，與淋巴結轉移和腫瘤分期顯著相關性，也有研究認為KRAS 突變比較頻繁，在患者的結腸腫瘤中時常出現突變［16-17］，沙如拉等［18］和常江等［19］報道CRC 中KRAS 突變率分別為37.8%和36.6%，與所有臨床病理指標均無明顯相關，本研究與上述部分結果相符。本研究顯示CRC中KRAS 總突變率為32.3%；與淋巴結轉移和Duke′s 分期顯著相關，在有淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組中KRAS 突變率分別為47.4%和36.5%，兩組之間差異有統計學意義，這一結果表明KRAS 在腫瘤細胞向癌旁及系膜組織的局部侵潤及轉移中發揮著重要作用，KRAS 突變率的高低可作為臨床評估腫瘤侵襲性、轉移力、患者預后的重要參考指標；在Duke′s 分期的A、B、C、D 期KRAS 突變率依次為23.4%、31.7%、42.3%、50.0%，兩兩間差異有統計學意義，KRAS 突變越高，浸潤深度越深，這一結果表明KRAS 在腫瘤細胞向腸壁浸潤的過程中起著一定作用。

C-erbB-2 和KRAS 同 為RAS/RAF/MAPK 信 號通路的上下游調控因子，C-erbB-2 可通過與家族中其他受體酪氨酸激酶形成異源二聚體發生磷酸化，募集下游信號蛋白SH2 和Grb2，活化調控分子SOS，隨之依次活化RAS 和RAF，最后級聯激活MAPK，將傳導信號轉入核內活化轉錄因子，導致細胞過度增殖、異常分化、引發癌變［20-21］。從理論上講C-erbB-2 和KRAS 具有協同作用。關于CRC中C-erbB-2 和KRAS 表達相關性的研究未見報道，本研究對C-erbB-2 擴增和KRAS 突變進行相關分析，發現二者表達并無相關關系；然而在本研究中檢出的4 例C-erbB-2 擴增中有發生1 例KRAS 突變，不難看出隨著樣本量的增大過表達量也會相應增加，表明C-erbB-2 擴增和KRAS 突變可發生在同一腫瘤組織中，且呈正相關，推測C-erbB-2 自身作用可能對CRC 的發生、發展影響不大，而通過激活下游信號分子進而刺激信號傳導通路的持續活化而發揮作用，也就是說兩者基因在腫瘤的發生發展中起著協同作用。對C-erbB-2 和KRAS 之間的調控機制還需要進一步的臨床研究和綜合資料的論證分析。