MicroRNA-574-5p對冠狀動脈平滑肌細胞生長的影響及其調控機制

楊曉偉，張拓偉，閆泱錦

(1.西北大學附屬醫院西安市第三醫院心血管內科；2.西安市中醫醫院心血管病科，陜西 西安 710018)

冠心病(coronary artery heart disease，CAD)是由冠狀動脈壁粥樣硬化斑塊所致，是導致患者死亡和殘疾的主要原因。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的異常增殖可促進動脈粥樣硬化斑塊的形成，而VSMCs凋亡可能與CAD相關炎癥的發生有關[1]。因此，了解動脈粥樣硬化斑塊發育中VSMCs的行為可為預防和治療CAD提供可能的靶點。MicroRNAs(miRNA)是小的非編碼RNA，其在轉錄后水平調節基因表達。在血管損傷的體內和體外研究中顯示[2]，miR-23b可調節VSMCs表型轉換。CAD和其并發癥的病理生理機制可能與miR-133a釋放入冠脈循環中有關[3]。既有研究[4]表明，在CAD患者血清中miR-574-5p表達增加，但其在CAD發生中的分子功能及調節的分子機制還尚未完全清楚。本研究通過檢測CAD患者外周血中miR-574-5p mRNA表達水平，以探討miR-574-5p對VSMCs增殖及凋亡的調控作用及分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

10例確診為冠心病的患者及10名體檢健康人來自西北大學附屬醫院西安市第三醫院心血管內科，其對本研究的目的均知情同意。取外周靜脈血制備成血清，于-80 ℃儲存備用。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將正常人T/G HA-VSMC(購自美國ATCC公司)培養在含10%胎牛血清和平滑肌細胞特異性生長因子的DMEM培養基中。在37 ℃、5%CO2的條件下培養。取第3～8代細胞進行隨后的實驗。

1.2.2 細胞轉染 嚴格按照說明書進行瞬時轉染。采用脂質體3000(美國Invitrogen公司)將miRNA-574-5p類似物以及它的陰性對照(購自廣州銳博生物科技有限公司)轉染入VSMCs中。轉染后48 h收集細胞，實時定量PCR檢測轉染效率。此外，采用脂質體2000(美國Invitrogen公司)將0.5 g pcDNA3.1/ZDHHC14或者pcDNA 3.1(由上海吉瑪制藥技術有限公司設計)對照質粒轉染入miRNA-574-5p類似物轉染的VSMCs中。于轉染后48 h收集細胞，進行后續試驗。

1.2.3 實時定量PCR 按照說明書，采用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)從細胞及血清中分離總RNA。隨后用反轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)將RNA反轉錄為cDNA。LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix(美國Invitrogen公司)檢測mRNA的表達。2-ΔΔCt方法進行數據分析。內參為β-actin。Primer Designing Tool在線軟件設計引物。見表1。

1.2.4 細胞增殖 MTT法檢測細胞增殖。將細胞以每孔103個細胞種植于96孔板中，分別培養1 d、2 d、3 d、4 d、5 d和6 d后檢測細胞增殖。按照操作說明書，在每孔中加入20 LMTT溶液，離心后棄去上清，再加入150 L二甲基亞砜，搖晃10 min。用酶標儀(美國Bio-rad公司制造)在波長570 nm處讀取吸光值。

表1 引物設計

1.2.5 細胞凋亡 收集對數期細胞，制成懸浮細胞后，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，再加入5 μL PI混勻。室溫避光反應5～15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡比例。

1.2.6 雙熒光素酶報告分析 PCR擴增ZDHHC14和突變序列的3′-UTR端，然后將擴增的序列插入pGL3熒光素酶啟動子載體(美國Promega公司)中構建報告基因質粒。限制性酶切位點為XbaⅠ和FseⅠ。采用脂質體2000將miRNA-574-5p類似物和ZDHHC14 3′-UTR或者突變的3′-UTR共轉染入VSMCs中，48 h后，采用Dual-GloLuciferase Assay(美國Promega公司)檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miRNA-574-5p在冠狀動脈疾病患者血清中的表達

與正常體檢者對比，CAD患者血清中miRNA-574-5p的表達顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 miRNA-574-5p調節VSMCs的增殖和凋亡

與陰性對照組相比，miRNA-574-5p類似物轉染后，miRNA-574-5p的表達顯著提高(P<0.01)。且miRNA-574-5p顯著提高VSMCs的增殖(P<0.01)，降低VSMCs的凋亡(P<0.01)。見圖2。

2.3 miRNA-574-5p的靶基因為ZDHHC14

采用在線miRNA 靶基因預測軟件TargetScan和MicroRNA Targets and Expression預測ZDHHC14為miRNA-574-5p的靶基因。雙熒光素酶報告分析結果顯示，miRNA-574-5p顯著降低ZDHHC14 3’-UTR端的熒光素酶活性(P<0.01)。且miRNA-574-5p抑制ZDHHC14的表達(P<0.01)。見圖3。

2.4 ZDHHC14影響VSMCs的增殖和凋亡

ZDHHC14過表達降低miRNA-574-5p誘導的VSMCs的增殖(P<0.05)，提高miRNA-574-5p誘導的VSMCs的凋亡(P<0.05)。見圖4。

3 討論

miRNAs可結合其靶基因的3′-UTRs，在轉錄和翻譯水平調節基因的表達。研究[5-6]表明，miRNAs在自體免疫疾病、發育異常以及心血管疾病等諸多生理病理過程中發揮重要作用。近幾年的研究也表明[7-8]，CAD中檢測出多種miRNAs表達異常。因此，調節miRNAs的表達可能是改善某些疾病發展過程的有效措施，如其可降低血管損傷誘導的VSMCs增殖、內皮細胞再生，以及降低病理性心肌肥大[9]。miRNA-574位于人染色體的內含子區域。最初認為[10]，miR-574-5p由人染色體4上編碼的Noxp20基因的第一個內含子調控的，但近期的研究發現[11-13]，miR-574-5p參與心血管疾病，肺癌和結腸癌等各種疾病。表明miR-574-5p參與眾多疾病的發展過程，涉及其調控的信號途徑也比較復雜。miR-574-5p可通過增加TLR9信號促進肺癌的發展[12]。在結腸癌組織中檢測出上調的miR-574-5p，且其促進結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[13]。此外，對心肌梗塞患者缺血部位的等級聚類分析顯示，miR-574-3p和miR-574-5p表達顯著增加[11]。

雖然miR-574-5p調控多種疾病，但是其在CAD中潛在的功能和分子機制仍沒有完全闡明。本研究顯示，與健康體檢者相比，miR-574-5p在CAD患者的血清中顯著上調。符合之前的研究結果，在CAD患者中，miR-574-5p表達增加[4]。此外，本研究也顯示，miR-574-5p可促進VSMCs增殖，抑制其凋亡。表明miR-574-5p是CAD相關因子，可能是CAD潛在的診斷性生物標志物以及治療的一個選擇。進一步的研究表明，腫瘤抑制基因ZDHHC14為miR-574-5p的靶基因[14]。本研究也表明，miR-574-5p可以結合在ZDHHC14 3′-UTR端，抑制其mRNA的表達。

ZDHHC14是DHHC棕櫚酰轉移酶家族的成員。人DHHC涉及神經障礙和癌癥等多種疾病，DHHC2與興奮性突觸的結構和功能可塑性相關[15]，與肝癌細胞的發展和轉移有關[16]。ZDHHC14也在胃癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤以及急性白血病等多種疾病中表達異常[17]。本研究表明，ZDHHC14過表達降低VSMCs增殖，促進VSMCs凋亡。因此，miR-574-5p通過靶向ZDHHC14基因參與CAD的調控，表明它可能成為CAD治療的一個靶點。

miR-574-5p也有其他的靶基因。miR-574-5p靶向BACE1調節認知缺陷中的心血管疾病[18]。miR-574-5p直接靶定檢查點抑制因子1促進肺癌細胞增殖[13]。miR-574-5p靶向癌癥細胞侵襲抑制因子調控乳頭狀甲狀腺癌細胞增殖[19]。本研究還沒有涉及miR-574-5p是否靶向調節細胞生長和凋亡的其他基因。因此，進一步的研究應該重點弄清miR-574-5p靶向其他基因在VSMCs調控中的作用。

總之，miR-574-5p在CAD患者的血清中表達增加，其過表達可通過靶向并下調ZDHHC14，促進VSMCs增殖及抑制其凋亡。miR-574-5p可能為CAD相關因子，并可能成為CAD治療的潛在分子靶點。