ARTN在食管鱗狀細胞癌中的表達及臨床病理聯系

陳雅琪，吳燕，黃一凡，文彬

(川北醫學院病理學教研室·川北醫學院附屬醫院病理科，四川 南充 637000)

食管癌是消化道常見惡性腫瘤，我國是食管癌的高發地區，高發區發病率約121/1萬，是世界低發病率地區的20倍以上，每年新發病例27萬以上，其中超過20萬的患者死亡，死亡率居第四位[1-2]，食管癌早期癥狀不明顯，發現時已經是中晚期，患者預后差，若能早期發現食管癌，能極大減輕患者痛苦，提高生存率。ARTN是膠質細胞源神經營養因子家族成員之一的蛋白編碼基因，ARTN與下游的GFRα3及RET形成復合物，激活SMAD家族轉錄因子，調節基因表達[3-4]。研究發現，ARTN蛋白在多種惡性腫瘤中表達，并發揮一定生物學作用，但ARTN與食管鱗狀細胞癌的關系上不明確。本實驗通過檢測ARTN在食管鱗癌中的表達，來探討ARTN與食管鱗狀細胞癌臨床病理參數及預后的關系。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

1.1.1 免疫組化標本 收集2009年1月1日至2010年9月30日川北醫學院附屬醫院存檔確診的食管鱗狀細胞癌包埋石蠟樣本本114例，患者年齡39～82歲，高級別上皮內瘤變樣本17例，年齡42～75歲，食管正常組織25例(以無腫瘤的切緣替代)作對照，年齡49～78歲。

1.1.2 Western blot標本 選取2014年3月至2014年6月川北醫學院附屬醫院心胸外科手術切除的新鮮食管腫瘤組織及配對的距腫瘤>5 cm的正常組織12例，年齡42～72歲，其中男性9例，女性3例，術后均確診為食管鱗狀細胞癌；切除后置于冰上，生理鹽水沖洗后以100 mg每份分裝于冷凍管，置于冷凍盒中于-80 ℃冰箱保存。

所有標本術前均未經放化療，與患者或家屬簽署相關知情同意書，符合醫學倫理學規定。

1.2 免疫組化

ARTN兔抗人多克隆抗體購自Abcom公司(稀釋濃度1∶50)，所選蠟塊冷凍后每個切白片3 μm厚，以胰腺癌標本做陽性對照，組織本身做陰性內對照，采用SP兩步法檢測ARTN蛋白的表達。ARTN陽性信號呈棕黃色顆粒，表達于鱗狀上皮細胞膜或者細胞質。結果判讀由ARTN陽性染色范圍及著色強度共同確定評分。陽性染色范圍以陽性細胞所占百分比劃分，無細胞著色判為0分；<25%為1分；25%～50%為2分；50%～75%為3分；>75%為4分。著色強度無色為0分；著色淺黃為1分；棕黃為2分；棕褐為3分。總分將兩者分數相加，由兩位副高及以上級別病理醫師共同打分，最后取平均分，≤2分為陰性(-)，3分為弱陽性(+)，4～5分為中等陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。

1.3 Western blot檢測

蛋白提取，BCA蛋白濃度測定，凝膠配置試劑盒、上樣緩沖液、電泳液、轉膜液、PVDF膜、超敏ECL發光液購于碧云天公司。操作按試劑盒說明進行，取食管鱗癌組織，癌旁組織各100 mg，加入液氮研磨成粉，按100 mg加入裂解液400 μL，充分混勻，冰上裂解，低溫離心，取上清液分裝，上清液按4∶1加電泳緩沖液于PCR儀上99 ℃變性15 min，與配置好的凝膠上樣電泳，濃縮膠80 V至分離膠時，改為120 V電泳至分離膠底部，剪裁與膠相適大小PVDF 膜，甲醇中活化15 s，轉膜，5%脫脂奶粉封閉3 h；4 ℃冰箱內一抗(ARTN濃度1∶3 000，GAPDH濃度1∶2 000)過夜，次日常溫二抗(1∶5 000)60 min，ECL發光，圖像采集。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 不同食管組織中ARTN蛋白的表達

ARTN蛋白主要定位于細胞膜和細胞質，呈棕黃或棕褐色。ARTN蛋白在正常食管黏膜上皮中不表達，在高級別上皮內瘤變組織和食管鱗狀細胞癌中的陽性表達率分別為23.5%及80.7%。癌組織陽性表達率明顯高于高級別上皮內瘤變及正常食管黏膜上皮。差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1和表1。

表1 不同食管組織中ARTN表達情況

注：N為正常組織，H為高級別上皮內瘤變組織，ESCC為食管鱗狀細胞癌組織。*P<0.05，與H比較；#P<0.01，與ESCC比較；△P<0.01，與N比較。

2.2 食管鱗狀細胞癌中ARTN蛋白表達與臨床病理特征的關系

114例食管鱗狀細胞癌中，男性89例，女性25例；年齡39～82歲，中位年齡57歲。統計ARTN蛋白與患者病例參數之間的關系，ARTN表達與浸潤深度，TNM分期有關(P<0.05)；與性別、年齡、腫瘤部位、分化程度、淋巴結轉移無關，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3 Western檢測ARTN蛋白在新鮮食管鱗癌組織及癌旁組織中的表達

手術室搜集新鮮標本，術后病理均確診為食管鱗狀細胞癌組織12例，搜集配對的癌旁組織(與癌組織距離﹥5 cm)。Western blot檢測以分子量36 KD的GAPDH作內參，相對表達量以ARTN與GAPDH灰度值比值表示，觀察ARTN蛋白的表達情況。結果發現ARTN蛋白在食管鱗癌組織和正常組織中均有不同程度的表達，但在食管鱗癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織中，差異具有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

表2ARTN蛋白的表達與食管鱗狀細胞癌病理特征的關系

2.4 生存分析

為評價ARTN的表達與食管鱗癌患者預后的關系，本次實驗通過電話對患者進行回訪，以手術出院之日至滿5年，共獲得39例資料。其中18例存活，總生存率46.2%。ARTN陽性表達的30例，11例存活,5年生存率為36.7%(11/30)。陰性表達占9例，7例存活，5年生存率77.8%(7/9)，ARTN陽性表達組五年生存率明顯低于陰性表達組，差別具有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

食管癌是消化道常見的惡性腫瘤，世界各地由于癌癥引起患者死亡的原因中，食管癌居第六位，每年新增病例超過48萬例[5]，食管癌組織學分類分為食管鱗狀細胞癌(esophagus squamous cell carcinoma，ESCC)及食管腺癌(esophagus adenocarcinoma，EAC或EAD)，歐美國家，食管腺癌的發生率有所升高，但仍以食管鱗癌為主，占80%以上[6-7]，治療方式包括手術，放化療及聯合治療，治療方式的選擇主要根據臨床TNM分期來確定，早期T1a期或更早的高級別上皮內瘤變患者可采用內鏡下粘膜剝除術，而避免食管切除術帶來的手術創傷，和由其增加的死亡率[8]。膠質細胞源神經營養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)家族成員包含四個因子， ARTN為其中之一，ARTN與其特異性配體GFRα1/ GFRα3(糖基化磷脂酰肌醇細胞膜受體1、3)形成復合體，其中與GFRα3的作用尤為明顯，再與絡氨酸激酶受體(RET)結合，通過三種途徑向細胞內傳導信號，除維持機體神經元存活，促進神經及上皮細胞的生長，分化和趨藥性方面發揮重要作用外，也與惡性腫瘤的發生相關，既往研究發現，ARTN與多種惡性腫瘤相關，女性生殖系統腫瘤多與激素相關，而激素與目前腫瘤的治療密切相關，ARTN在女性生殖系統腫瘤如乳腺癌，子宮內膜癌中表達，除與腫瘤的發生發展，浸潤轉移等臨床病理因素有關外，更與激素及藥物治療關系密切[9-11];呼吸系統腫瘤，ARTN在喉鱗癌，肺非小細胞癌中表達上調，與喉癌TNM分期及預后相關， 肺非小細胞癌淋巴結轉移，腫瘤分期相關[12-13];消化系統腫瘤，ARTN在食管鱗癌細胞株表達上調，并促進癌細胞轉移侵襲，與胃腺癌浸潤深度、TNM分期相關，在腸腺癌，ARTN與腫瘤分化程度，浸潤深度，Dukes分期及淋巴結轉移相關，另在肝細胞肝癌，胰腺癌中均有表達，且發揮一定生物學作用[14-17]。但ARTN與食管鱗癌中的臨床病理聯系、預后等作用尚不明確，本次實驗初步探索ARTN在正常食管組織，高級別上皮內瘤變組織及食管鱗癌組織中的表達，結果發現，高級別上皮內瘤變組織與正常組織相比，ARTN表達升高，差別具有統計學意義(P<0.01)，食管鱗癌中，ARTN表達更高，差別具有統計學意義(P<0.01)；另Western-blot結果ARTN在鱗癌組織中表達高于正常組織(P<0.01)，可見ARTN在腫瘤中表達升高，這與ARTN作為一種癌癥干細胞樣(cancer stem cell-like,CSC-like)作用相關，不僅具有CSC樣作用，也具有促進上皮到間質轉換作用，促進腫瘤的發展，并具有更高的侵襲性[18]；此外，ARTN表達水平與腫瘤浸潤深度、臨床分期及預后相關，浸潤越深，ARTN表達程度與臨床分期呈正相關，與患者生存率呈負相關，說明ARTN促進食管鱗癌進展。細胞持續增殖和生長是癌癥的重要特征，腫瘤所處的微環境包括氧含量、血管生成等，在腫瘤的形成中起重要作用，腫瘤生長過程中，癌細胞之間的黏附能力下降，癌細胞由于黏附力下降，易脫落，從而形成轉移，而ARTN與促進缺氧誘導因子(HIF)、血管內皮生長因子(VEGF)的表達相關，能促進缺氧微環境，促進血管生長，從而促進腫瘤發生進展[16]，ARTN降低鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達，上調ARTN的表達，E-cadherin的表達下降，癌細胞粘附力下降，腫瘤的侵襲及轉移能力增加[19]；實驗結果與ARTN作用相符。另外，本實驗研究發現，ARTN與淋巴結轉移無關，這與ARTN促進腫瘤轉移的作用相矛盾，分析原因：(1)ARTN促進腫瘤轉移是在其某一通道上起作用，食管鱗癌中，可能不存在促進腫瘤轉移的這一通道，故與淋巴結轉移無關。(2)ARTN可促進神經侵襲，這個理論在既往文獻中有報道，而又有神學者提出經侵襲可能是除腫瘤經典轉移方式之外的新的轉移方式[20]，可能本次實驗中所取樣本患者鱗癌轉移方式除淋巴結轉移外，尚存在神經侵襲方式，故與ARTN作用不全相符。(3)所取樣本距今時間較長，由于環境改變，不能全排除所取樣本患者發生遺傳物質改變的可能。故ARTN在食管鱗癌中是否與神經侵襲相關，神經侵襲與患者臨床預后的關系將是我們下一步工作目標。

綜上所述，本次研究證實了ARTN在從食管鱗癌癌前病變進展到食管鱗癌的過程中，表達量逐漸升高，且與患者腫瘤浸潤深度、臨床分期及預后相關，推測ARTN參與食管鱗癌的進展，可望成為監測患者病情及判斷預后的新的生物學指標。