灰樹(shù)花β多糖通過(guò)激活氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡

陶佳，牛靜靜，郝世莉，劉家有

(1.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室·川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，四川 南充 637000；2.西安市胸科醫(yī)院病理科，陜西 西安 710100；3.重慶市第七人民醫(yī)院兒科，重慶 400054；4.川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，四川 南充 637000)

肺癌是目前嚴(yán)重威脅人類健康的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率位居所有惡性腫瘤首位。盡管聯(lián)合使用吉西他濱，紫杉類等新的化療藥物與順鉑是目前治療肺癌的一線治療方案，但是臨床大數(shù)據(jù)顯示肺癌患者5年生存率仍較低[1]。灰樹(shù)花是一種食用菌，兼有重要的藥用價(jià)值，主要分布于我國(guó)浙江，河北，四川，云南，福建等省。近30年來(lái)，研究人員從灰樹(shù)花子實(shí)體和菌絲中提取出近幾十種活性物質(zhì)，大部分是具有生物活性的多糖物質(zhì)，包括MD-型、X-型和D-型等。研究[2]發(fā)現(xiàn)，灰樹(shù)花提取物多糖成分是一種較好的免疫佐劑。Kodama等[3]研究發(fā)現(xiàn)，D-Fraction能夠激活巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致IL-12生成增多。Inoue等[4]研究發(fā)現(xiàn)，D-Fraction在調(diào)控T淋巴結(jié)Th1/Th2的比率方面發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)，有研究表明灰樹(shù)花提取物在抗腫瘤方面發(fā)揮著重要的作用。例如，D-Fraction能夠顯著抑制犬癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]。在荷瘤小鼠中，灰樹(shù)花D-Fraction能夠增強(qiáng)抗腫瘤效應(yīng)，減弱絲裂霉素誘導(dǎo)的免疫抑制作用[2]。荷瘤小鼠口服灰樹(shù)花提取物β-葡聚糖能夠增強(qiáng)系統(tǒng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)，減弱免疫抑制作用[6]。基于此，課題組提出疑問(wèn)，灰樹(shù)花提取物對(duì)肺癌細(xì)胞的生存與凋亡有無(wú)影響？迄今為止，尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究灰樹(shù)花β-多糖對(duì)肺癌細(xì)胞的生存與凋亡的影響，明確灰樹(shù)花β-多糖具有抑制肺癌細(xì)胞生存的特性；并初步探討灰樹(shù)花β-多糖誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)灰樹(shù)花β-多糖通過(guò)誘發(fā)肺癌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，促使胞內(nèi)活性氧生成增多，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料

肺癌細(xì)胞A549和LA795為本實(shí)驗(yàn)室保存的細(xì)胞株。F-12K細(xì)胞培養(yǎng)液(Invitrogen，美國(guó))，胎牛血清(Hyclone，美國(guó))，D-Fraction(Mushroom wisdom，美國(guó))，CCK-8，細(xì)胞線粒體分離試劑盒(碧云天，中國(guó))，MitoSOX和TMRM染料(Invitrogen，美國(guó))，Annexin-V FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(貝博，中國(guó))，細(xì)胞色素c，Bcl-2，Bax，Bak，β-actin，COXⅣ抗體(Abcam，美國(guó))

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)液于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549和LA795。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞接種于96孔板。24 h后，更換培養(yǎng)基，使其含有不同濃度的D-Fraction。后續(xù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)加入10 μL CCK-8試劑。避光孵育1 h后，在450 nm處檢測(cè)光吸收值。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞接種于6孔板。24 h后，更換培養(yǎng)基，使其含有不同濃度的D-Fraction。48 h后，常規(guī)收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗兩次，加入400 μL結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞。于避光條件下，加入10 μL Annexin V-FITC染料，混勻，4 ℃孵育10 min。加入5 μL PI染料，混勻，4 ℃避光孵育10 min，上機(jī)檢測(cè)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MitoSOX檢測(cè)線粒體ROS

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞接種于共聚焦顯微鏡專用Dish中。24 h后，更換培養(yǎng)基，使其含有不同濃度的D-Fraction。48 h后，用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗三次。加入Mito SOX染料，37 ℃避光孵育10 min。棄染液，加入500 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，于共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。用Image J軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度。每組3個(gè)復(fù)孔，每孔隨機(jī)拍攝5個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 TMRM檢測(cè)線粒體膜電位

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞接種于共聚焦顯微鏡專用Dish中。24 h后，更換培養(yǎng)基，使其含有不同濃度的D-Fraction。48 h后，加入TMRM染料，使其終濃度為100 nM，37 ℃避光孵育30 min。棄染液，加入500 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，于共聚焦顯微鏡下觀察，拍照。用Image J軟件計(jì)算熒光強(qiáng)度。每組3個(gè)復(fù)孔，每孔隨機(jī)拍攝5個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 分離線粒體蛋白

常規(guī)收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗3次。加入1 mL線粒體分離試劑，懸浮細(xì)胞，冰浴15 min。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中，勻漿約20下。600 g，4 ℃離心10 min。取上清，轉(zhuǎn)移至新的離心管，11 000 g，4 ℃離心10 min。收集上清即為不含線粒體的胞漿蛋白；收集沉淀即為線粒體。隨后采用細(xì)胞裂解液裂解線粒體，即可獲得線粒體蛋白。

1.8 Western Blot

常規(guī)收集細(xì)胞。用細(xì)胞裂解液于冰上裂解細(xì)胞，獲得細(xì)胞蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。加入適量5×SDS-PAGE緩沖液，煮沸，變性。后續(xù)經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育(4 ℃，過(guò)夜)，二抗孵育等步驟。最后將PVDF膜置于采集器內(nèi)，發(fā)光，拍照。β-actin為胞漿蛋白內(nèi)參照，COXⅣ為線粒體蛋白內(nèi)參照。用Quantity One軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件分析。多組數(shù)據(jù)分析采用方法檢驗(yàn)，兩組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 灰樹(shù)花β多糖抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)

如圖1所示，灰樹(shù)花β多糖處理能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。并且，灰樹(shù)花β多糖抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)呈劑量依賴性。2.5 μg/mL灰樹(shù)花β多糖對(duì)肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)抑制率為(35.13±2.89)%，對(duì)LA795細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為(25.09±3.64)%；與對(duì)照組相比，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5 μg/mL灰樹(shù)花β多糖對(duì)肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)抑制率為(45.68±3.81)%，對(duì)LA795細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為(32.82±3.67)%；與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。10 μg/mL灰樹(shù)花β多糖對(duì)肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)抑制率為(54.54±2.14)%，對(duì)LA795細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為(42.52±2.69)%；與對(duì)照組相比，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，灰樹(shù)花β多糖劑量取5 μg/mL進(jìn)行研究。

2.2 灰樹(shù)花β多糖促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡

如圖2所示，灰樹(shù)花β多糖處理能夠顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。5 μg/mL灰樹(shù)花β多糖處理48 h后，肺癌細(xì)胞A549的細(xì)胞凋亡率為(37.80±3.76)%，與對(duì)照組(4.30±0.80)%相比，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5 μg/mL灰樹(shù)花β多糖處理48 h后，肺癌細(xì)胞LA795的細(xì)胞凋亡率為(40.80±5.81)%，與對(duì)照組(4.43±0.78)%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 灰樹(shù)花β處理誘發(fā)肺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激

如圖3所示，灰樹(shù)花β多糖處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生顯著增多。5 μg/mL灰樹(shù)花β多糖處理48 h后，肺癌細(xì)胞A549的ROS相對(duì)水平為(1 299.67±37.21)，與對(duì)照組(580.33±17.75)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5 μg/mL灰樹(shù)花β多糖處理48 h后，肺癌細(xì)胞LA795的ROS相對(duì)水平為(1133.00±115.02)，與對(duì)照組(513.67±31.33)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 灰樹(shù)花β處理降低肺癌細(xì)胞線粒體膜電位

如圖4所示，灰樹(shù)花β多糖處理后，線粒體膜電位顯著降低。5 μg/mL灰樹(shù)花β多糖處理48 h后，肺癌細(xì)胞A549的線粒體膜電位的相對(duì)水平為(399.67±59.87)，與對(duì)照組(980.33±64.15)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5 μg/mL灰樹(shù)花β多糖處理48 h后，肺癌細(xì)胞LA795的線粒體膜電位的相對(duì)水平為(299.87±37.21)，與對(duì)照組(1007.01±35.39)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 灰樹(shù)花β處理促進(jìn)肺癌細(xì)胞Cyto-c從線粒體釋放

如圖5所示，灰樹(shù)花β多糖處理促進(jìn)Cyto-c從線粒體釋放至胞漿。5 μg/mL灰樹(shù)花β多糖處理48 h后，Cyto-c在胞漿中的相對(duì)表達(dá)水平為(0.61±0.04)。與對(duì)照組(0.12±0.06)相比，其在胞漿中的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。5 μg/mL灰樹(shù)花β多糖處理48 h后，Cyto-c在線粒體中的相對(duì)表達(dá)水平為(0.22±0.05)。與對(duì)照組(0.51±0.04)相比，其在線粒體中的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

2.6 灰樹(shù)花β處理促進(jìn)肺癌細(xì)胞Bcl-2家族分子發(fā)生轉(zhuǎn)位

如圖5所示，灰樹(shù)花β多糖處理促進(jìn)Bcl-2從線粒體轉(zhuǎn)位至胞漿；促進(jìn)Bax和Bak從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體。5 μg/mL灰樹(shù)花β多糖處理48 h后，Bcl-2在線粒體中的相對(duì)表達(dá)水平為(0.45±0.05)。與對(duì)照組(1.01±0.06)相比，其在線粒體中的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。5 μg/mL灰樹(shù)花β多糖處理48 h后，Bax在線粒體中的相對(duì)表達(dá)水平為(0.41±0.02)。與對(duì)照組(0.12±0.005)相比，其在線粒體中的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。5 μg/mL灰樹(shù)花β多糖處理48 h后，Bak在線粒體中的相對(duì)表達(dá)水平為(0.29±0.07)，與對(duì)照組(0.05±0.01)相比，其在線粒體中的相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

3 討論

灰樹(shù)花是一種生長(zhǎng)在亞熱帶的大型食用菌，具有重要的藥用價(jià)值。別名栗蘑，多葉奇果菌[7]。在日本稱為“舞茸”。自上世紀(jì)八十年代以來(lái)，研究人員陸續(xù)從灰樹(shù)花子實(shí)體和菌絲中提取出幾十種活性多糖成分，包括MD-型，X-型，和D-型等。D-Fraction主要由兩種葡聚糖組成，包括：以β-(1-6)結(jié)合為主鏈，β-(1-3)結(jié)合為側(cè)鏈的葡聚糖和以β-(1-3)結(jié)合為主鏈，β-(1-6)結(jié)合為側(cè)鏈的葡聚糖。研究發(fā)現(xiàn)，灰樹(shù)花提取物多糖成分具有較強(qiáng)的生物調(diào)節(jié)活性。它在免疫調(diào)節(jié)，抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展，拮抗HIV病毒，血糖血壓調(diào)節(jié)，調(diào)控脂肪代謝等方面發(fā)揮著重要的作用。在胰島素抵抗的KK小鼠中，X-fraction能夠調(diào)控葡萄糖/胰島素代謝，其機(jī)制可能是通過(guò)增強(qiáng)外周胰島素敏感性[8]。在2型糖尿病小鼠KK-Ay中，MT-α-葡聚糖通過(guò)與胰島素受體相互作用抵抗糖尿病[9]。此外，灰樹(shù)花多糖活性成分在血壓調(diào)節(jié)方面發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病小鼠口服灰樹(shù)花多糖成分SX-fraction能夠顯著降低收縮壓和空腹血糖[10]。載體蛋白E敲除小鼠口服灰樹(shù)花提取物后，血清總膽固醇水平顯著降低，表明灰樹(shù)花提取物能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[11]。Lin等[12]研究發(fā)現(xiàn)MD-Fraction以劑量依賴的方式作用于造血骨髓干細(xì)胞，促進(jìn)骨髓干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。此外，灰樹(shù)花活性成分在免疫調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮著重要的作用。Kubala等[13]研究發(fā)現(xiàn)，D-葡聚糖能夠激活血液吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，具體表現(xiàn)為：血液中ROS水平升高，促炎因子IL-6，IL-8，TNFα水平升高。Kodama等[3]研究發(fā)現(xiàn)，D-Fraction通過(guò)激活巨噬細(xì)胞，促進(jìn)IL-12生成增多，最終導(dǎo)致NK細(xì)胞殺傷活性增強(qiáng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，D-Fraction處理能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。Kodama等還發(fā)現(xiàn)，D-Fraction通過(guò)激活巨噬細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞，和T細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。Konno[5]的研究結(jié)果表明D-Fraction能夠有效的抑制犬癌細(xì)胞生長(zhǎng)或直接殺死癌細(xì)胞。在荷瘤小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，口服D-Fraction或腹腔注射D-Fraction均能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)[6]。Shomori等[14]研究發(fā)現(xiàn)灰樹(shù)花提取物能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。D-Fraction聯(lián)合化療藥物絲裂霉素能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[2]。近年來(lái)，灰樹(shù)花提取物抑制腫瘤生長(zhǎng)是否依賴于免疫系統(tǒng)的激活仍存在分歧。Sanzen等[15]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D-Fraction以依賴激活巨噬細(xì)胞的方式抑制肝癌細(xì)胞Huh-1生長(zhǎng)。與Sanzen等研究結(jié)果一致，Masuda等[16]研究結(jié)果表明，MD-Fraction通過(guò)激活NK細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞，抑制胞內(nèi)粘附分子(intracellular adhesion molecule，ICAM-1)，最終抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。然而，Aloso等[17]研究發(fā)現(xiàn)，D-Fraction以不依賴于免疫系統(tǒng)的方式，直接作用于腫瘤細(xì)胞，并能夠顯著降低腫瘤細(xì)胞活力，降低乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲活性，最終導(dǎo)致細(xì)胞侵襲性行為減弱。并且，D-Fraction能夠顯著降低荷乳腺癌小鼠的腫瘤負(fù)荷和肺轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。本次研究結(jié)果與Aloson等的研究結(jié)果一致，顯示D-Fraction能夠直接作用于肺癌細(xì)胞，抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。

研究結(jié)果表明，D-Fraction能夠誘發(fā)肺癌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生顯著增多，線粒體膜電位降低，細(xì)胞色素c從線粒體釋放至胞漿，Bcl-2從線粒體外膜轉(zhuǎn)位至胞漿，Bax和Bak從胞漿轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，最終導(dǎo)致肺癌細(xì)胞凋亡。Shomori等發(fā)現(xiàn)，灰樹(shù)花提取物處理胃癌細(xì)胞后，胞漿細(xì)胞色素c水平顯著升高，caspase 3和ADPR活化形式水平顯著升高，而p21和Bax的水平不變，細(xì)胞發(fā)生凋亡。Soares等[18]研究發(fā)現(xiàn)，D-Fraction通過(guò)上調(diào)Bax基因表達(dá)，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。近年來(lái)，有研究報(bào)道D-Fraction也能夠通過(guò)調(diào)控血管生成發(fā)揮抗腫瘤作用[19]。Sanzen等研究表明，D-Fraction處理能夠激活巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致一氧化氮合酶介導(dǎo)的一氧化氮合成增多，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。以上研究表明，灰樹(shù)花提取物D-Fraction在多種惡性腫瘤細(xì)胞中均能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制不盡相同，這可能與細(xì)胞類型及細(xì)胞所處的環(huán)境有關(guān)。

總之，本研究首次報(bào)道了灰樹(shù)花提取物D-Fraction能夠抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能是通過(guò)誘發(fā)肺癌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，促使細(xì)胞內(nèi)活性氧生成增多，線粒體功能受損，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。