H19基因在骨肉瘤中的表達及其對預后的影響

李勇，高書明，劉廣飛，王路，盧守亮，程才

(滄州市中心醫院骨一科，河北 滄州 061001)

骨肉瘤是最常見的間質細胞來源的惡性腫瘤之一，其周圍血流豐富，早期可發生轉移，死亡率較高[1]。雖然手術技術的提高及放化療的應用逐漸成熟，但是其5年生存率未見明顯提高[2]。隨著腫瘤基因研究越來越深入，分子靶向治療已成為近年來研究的熱點[3]。既往研究[4]發現骨肉瘤的發生與p14ARF、RB和p16INK4等原位基因激活或基因重組及突變有關。H19基因正常情況下的最終表達產物為RNA，但是當異位H19的ORF6非翻譯區發生突變或者刪失可能會產生蛋白質，并且可導致細胞的惡變。目前，相關研究[5-6]發現H19基因在多種惡性腫瘤中均為高表達，如膀胱癌、肺癌等。而H19基因與骨肉瘤之間的關系目前研究較少，本研究旨在探討H19基因在骨肉瘤中的表達及其對預后的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年4月至2018年4月滄州市中心醫院收治的肉瘤患者81例，所有患者均經病理證實為骨肉瘤，同時選取非腫瘤組織作為配對研究，非腫瘤組織包括癌旁組織(距腫瘤邊緣<3 cm)及瘤遠旁組織(距腫瘤邊緣>5 cm)。所有患者均經放化療。入選患者中，男性48例，女性33例，年齡14～56歲，平均年齡(24.45±3.21)歲。所有病理標本手術切除后保存于液氮中，用于后期檢測，所有入選患者均簽署了知情同意書，所有臨床病理資料通過翻閱病歷收集。

1.2 試劑

PCR反應試劑盒、反轉錄試劑盒、內切酶Rsa I、Trizol試劑、mRNA Marker I(北京天為時代)。H19及GAPDH的上下游引物(上海生工生物工程技術有限公司合成)見表1。

表1H19及GAPDH的上下游引物

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR (1)RNA提取：組織剪碎后用Trizol提取RNA，并用分光光度儀測純度及含量(A260/A280大約為1.8～2.0)。(2)RT-PCR：首先采用反轉錄試劑盒，按照說明書進行emRNA鏈合成，然后emRNA，按照PCR反應試劑盒說明書進行PCR擴增。擴增條件：95 ℃預變性2 min，94℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72qc延伸30 s，循環30個周期后，最后72 ℃延伸7 min。PCR的參考體系為GAPDH。將H19及β-actin一起上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀分析電泳結果，Dolphin分析軟件測定灰度值，樣本的灰度值與β-actin的比值作為最終結果。

1.3.2 RFLP檢測H19印跡狀態 限制性酶切反應體系：主要包括2μL 10×Buffer，10 U。內切酶Rsa I，PCR產物37 ℃水浴酶切過夜，然后做瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相。酶切后若為142 bp、247 bp或105 bp條帶，則為單等位基因表達，即正常印跡；若為3條不同的條帶(247 bp、105 bp和142 bp)，則為印記基因丟失(loss of imprinting，LOI)。

1.4 統計學分析

采用SPSS 19.0分析，計數資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 H19mRNA在骨肉瘤、癌旁組織及癌旁遠組織的表達

將提取的mRNA進行瓊脂糖凝膠電泳，顯像后如圖1所示。H19mRNA在骨肉瘤組織中高表達，在癌旁組織及癌旁遠組織中低表達。待測樣本中β-actin均有表達，提示標本中總RNA及RT-PCR反應有效。

2.2 RT-PCR-RFLP法檢測骨肉瘤中H19 mRNA印跡狀態

所有病理標本中，骨肉瘤、癌旁組織及癌旁遠組織的H19 mRNA表達率分別為43.2%，14.8%，3.7%，LOI的發生率與不同組織之間有顯著相關性(P<0.05)。見圖2。

2.3 H19基因與骨肉瘤臨床病理資料的關系

81例骨肉瘤患者中，H19基因表達與肺轉移，Enneking分期有關，且高表達的骨肉瘤患者2年生存率明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。H19基因表達與性別、年齡、腫瘤大小、部位及病理分型無明顯相關(P>0.05)。見表2。

表2H19基因與骨肉瘤臨床病理資料的關系(例)

3 討論

骨肉瘤作為最常見的間質組織惡性腫瘤之一，惡性程度較高，早期易發生肺部轉移，預后較差。因此，尋找骨肉瘤發生發展的根源并找出治療靶點是目前研究治療骨肉瘤的熱點[7]。H19基因定位到人的染色體為11p15.5，基因長度為3 kb，其中主要包括4個內含子和5個外顯子。目前，體內尚未發現H19的蛋白表達，故認為其可能不參與翻譯，但其mRNA水平可以檢測到，因此主要影響翻譯水平[8]。目前，研究[9]發現H19基因的突變及丟失率極高，均超過了p53基因。

近年來，研究發現H19基因與腫瘤的發生密切相關。研究[10]發現H19mRNA通過調控腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲及血管形成的基因表達，影響腫瘤的發生和發展。目前，已有研究[11]證實H19基因在多種腫瘤中的陽性率高于正常組織，如宮頸癌、腸癌及食管癌等，且其可以作為肝癌和宮頸癌的復發、轉移及預后的評估因素之一。作為印跡蛋白，H19致癌的方式是雜合性丟失，或者單親二倍體，主要表現為同源染色體中兩條等為基因丟失或是突變活性導致其中一個抑癌基因的功能拷貝丟失，表達增加，或者是印跡控制中心的突變失去活性，最終導致多個印跡的癌基因表達異常[12]。

本研究指出H19mRNA在骨肉瘤組織中高表達，在癌旁組織及癌旁遠組織中低表達，說明癌細胞中H19mRNA呈高表達狀態。其原因可能是H19mRNA可以通過多種途徑調節染色質重構、DNA甲基化、組蛋白修飾，且H19mRNA作為miRNA的前體，繼而從基因水平、轉錄水平以及蛋白質翻譯水平調控機體的功能[13]。此外，LOI的發生率與不同組織之間有顯著相關性(P<0.05)。其原因可能是H19 基因可轉錄出一種長鏈非編碼 RNA H19，可以調節染色質重構、 DNA 甲基化，也可作為 miRNA 的前體，在細胞內對組蛋白進行修飾，繼而從基因水平、轉錄水平以及蛋白質翻譯水平調控機體的功能。而不同組織中，H19基因與其產物miRNA呈現的表達水平不同，導致其LOI的發生率出現差異[14]。骨肉瘤患者中，H19基因表達與肺轉移、Enneking分期有關，且高表達的骨肉瘤患者2年生存率明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。這提示H19基因在轉錄及轉錄后水平，其過表達與靶基因的狀態、細胞的類型、細胞的發育階段及臨床病理分級、激素及淋巴結轉移有關，這與王彩霞等[15]研究結果相似。

綜上所述，H19基因在骨肉瘤中高表達，且與肺轉移、Enneking分期有關，H19基因高表達的患者預后差，H19基因可作為判斷骨肉瘤預后的指標之一。