基于碳納米管組裝無電子媒介體電流型乙腦疫苗免疫傳感器研究

董軍

(川北醫學院化學教研室，四川 南充 637000)

乙腦疫苗的含量測定直接影響著其對流行性乙型腦炎的預防效果。目前，乙腦疫苗含量檢測方法主要有動物法、蝕斑試驗法和酶聯免疫吸附法，這些經典方法使用廣泛但也存在一些不足，例如操作繁瑣、檢測周期較長、靈敏度較低，對實驗人員要求較高等[1-3]。因此，發展簡捷、靈敏度高的檢測方法不論對醫學理論研究還是臨床檢測都具有重要意義。免疫傳感器是利用抗原-抗體間特殊的結合反應來測定痕量物質的一種高靈敏度方法，近些年來關于乙肝病毒、腫瘤標記物、甲胎蛋白等免疫傳感器的研究取得了快速發展[4-6]。但關于乙腦免疫傳感器的研究相對缺乏，仍有大量基礎工作需要完善。其中如何提高抗體活性負載量及信號靈敏度是亟待解決的關鍵問題之一[7-8]。

碳納米管獨特的結構和電學性質使其在傳感器領域具有巨大的應用潛力。研究表明碳納米管可發揮分子導線作用，利于生物分子與電極間的電子傳遞，在生物傳感方面表現出優異的性質[9-10]。Wang等[11]認為碳納米管可以和生物兼容性更好的材料結合，這樣不但可以提高生物活性物質負載量，而且可以更好保持生物分子活性，提高傳感器的響應信號。據此，本研究以多壁碳納米管為載體提高生物兼容性較好的金微粒負載量，從而提高乙腦疫苗抗體固定量，并保持抗體良好的生物活性；利用辣根過氧化氫酶對H2O2的反應增強電流信號，提高響應靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料

循環伏安法、恒電位法和計時電流法在LK98BⅡ綜合電化學分析系統(天津市蘭力科化學電子高技術有限公司)測量；PHS-2F型酸度計 (上海儀電科學儀器股份有限公司)，BS110S電子天平 (北京賽多利斯天平有限公司)；KQ—400DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，工作頻率為 60 kHz。實驗采用三電極體系，修飾過的玻碳電極 (GC) 為工作電極，飽和甘汞電極 (SCE) 為參比電極，鉑片電極為對電極。

多壁納米碳管(MWCNT，深圳市納米港有限公司)，乙腦疫苗、乙腦疫苗疫苗抗體、腮腺炎疫苗、水痘疫苗和風疹疫苗(上海科華生物工程公司提供)；氯金酸(四川化學試劑廠)，辣根過氧化物酶(HRP)及牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，美國)，所用化學試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 傳感器制備方法 Au/MWCNT/GC電極制備方法：MWCNT(10～30 nm)的氧化處理參考文獻[12]。取碳納米管1.0 g，在濃HCl中回流3 h純化，洗滌至中性，再將碳納米管置于濃HNO3中回流4 h，洗滌至中性后在120 ℃下烘干，制得羧基化碳納米管。稱取羧基化的MWCNT 10 mg用10 mL 十六烷基胺超聲震蕩分散2 h，配成帶有氨基，濃度為1 mg/mL的羧基化碳納米管分散系。玻碳電極(?：2 mm)用1800#、2000#均相砂紙拋光，重蒸水沖洗3次，再依次在丙酮、10%的氫氧化鈉、HNO3(v)∶H2O(v)=1∶1的溶液中超聲振蕩三分鐘，取出重蒸水沖洗，置于室溫下干燥；滴加1 mg/mL的黑色溶液3 μL，紅外燈烤干，以該電極為工作電極，在三電極體系中，-2.5 V恒電壓下電沉積 120 s。電沉積完成后，取出電極，重蒸水沖洗2次，室溫下過夜干燥得到Au/MWCNT/GC電極。

免疫傳感器的制備方法：將Au/MWCNT/GC電極置于乙腦疫苗抗體溶液中在4 ℃浸泡4 h，再將電極置于0.25% BSA溶液中于常溫孵育2 h以封閉活性基團，最后用1 mg/mL HRP取代BSA封閉非特異性活性位點，在37 ℃恒溫封閉30 min，制得HRP/乙腦疫苗抗體/Au/MWCNT/GC免疫傳感器。圖1所示為免疫傳感器制備流程圖。

1.2.2 測試方法 組裝不同階段電極的電化學表征：電極在組裝過程中的不同階段用循環伏安法進行表征。三電極體系，于含0.1 mol/L KCl 與0.2 mol/L PBS (pH7.4)溶液中在0～1 V電位范圍內進行循環伏安掃描，掃描前PBS溶液通氮氣5 min。

免疫傳感器在抗原溶液中培育時間的選擇：采用三電極體系，以HRP/乙腦疫苗抗體/Au/ MWCNT/GC免疫傳感器為工作電極。在含6.4×10-7lg pfu/mL的乙腦疫苗磷酸鹽生理緩沖溶液(pH 7.4)中，采用計時電流法記錄不同時間電流穩定后的電流值(I)，并用I相對于電沉積時間(t)做圖，通過該圖討論免疫傳感器在抗原溶液中培育時間的選擇。

免疫傳感器對乙腦疫苗響應：三電極體系，免疫電極為工作電極，先測量在0.5×10-3mol/L H2O2+0.1 mol/L KCl+2 mmol/L PBS (pH7.4)電解質溶液中的電位I0(空白電位)，然后向電解質溶液中加入不同濃度的乙腦疫苗溶液，攪拌4 min，記錄相應電位值I，傳感器對系列濃度乙腦疫苗溶液的電流響應按公式：△I=I0-I進行計算。由于抗原與固定在電極上的抗體結合后，生成的抗原-抗體復合物堵塞導電通道，使得電子有效擴散面積減小，電流減小，因此響應電流值I與乙腦疫苗濃度成反比，最后用△I對lgC(乙腦疫苗)制作標準曲線。

2 結果與討論

2.1 實驗條件選擇

2.1.1 電沉積時間對電流影響 圖2是Au/MWCNT/GC電極的響應電流與時間關系圖，其中峰電流(Ip)根據該電極在2.5 mmol/L Fe(CN)64-/3-+0.1 mol/L KCl+PBS(pH7.4)溶液中循環伏安曲線中位于-0.26 V和0.10 V處觀察到的氧化還原峰，利用公式Randles-Sevcik 方程：Ip=2.69×105AD1/2n3/2γ1/2C(D，n，γ和C均為常數，電極的電活性表面積(A)與氧化還原峰的峰電流之間成正比)計算得到[13]。從圖中可看出，電沉積時間與峰電流并不會隨著Au含量的增加而增加，而是沉積時間為120 s時，Au/MWCNT/GC電極的響應峰電流值出現最大值，Ip(120)是沉積時間分別為 90 s 和 150 s 的峰電流的 1.2 倍和1.1倍。這主要是因為金微粒的堆積及分布方式不同造成，沉積時間較短時，金粒子多數為納米或微米級，并能夠充分與納米碳管接觸，但時間過短時金微粒沉積較少，隨著時間的延長，碳納米管表面能夠充分負載金粒子，且金粒子相對均勻，粒徑可保持在微米級以下，有效利用碳納米管的空間結構和高比表面積，導電有效面積更大；而更長時間的電沉積雖然金含量增加，但完全覆蓋碳納米管，會形成較為光滑金面，金顆粒粒徑不斷增大，反而會使有效導電面積減小，因此峰電流也會降低。

2.1.2 免疫傳感器在抗原溶液中培育時間的選擇 圖3為HRP/乙腦疫苗抗體/Au/ MWCNT/GC免疫傳感器與乙腦疫苗的動力學響應曲線。從圖中可看出，在測試時間范圍，傳感器表面負載抗體與緩沖溶液中抗原的反應可分為兩個階段，即抗原-抗體快速結合階段和抗原-抗體反應達到平衡階段。在快速響應階段，免疫電極表面上的抗體與溶液中的抗原迅速結合，形成非良性導電體的抗原-抗體復合物，由于免疫復合物導電性很弱，增大了電子擴散阻力，減弱電子向電極表面的擴散，從而會減少復合電極的有效導電面積，從而響應電流值明顯減小；隨著時間的延長，至4 min左右，響應電流基本達到穩定，表明抗原-抗體結合達到平衡，因此本實驗選用的最佳培育時間是4 min。

2.1.3 免疫傳感器在抗原溶液中培育溫度及pH的選擇 圖4分析了溫度(a)和pH(b)對免疫反應影響。從圖4a可以看出溫度在15 ℃至37 ℃范圍，響應電流會隨著溫度的升高逐漸減小，37 ℃時達到最小，約57 μA，這說明抗原—抗體結合密度達到最大，但溫度超過37 ℃時，電流強度反而會隨著溫度的升高而升高，這歸因于抗原、抗體的活性在較高溫度下易被破壞，不利于兩者的結合。實驗中由于溫度升高，部分免疫復合體被破壞，電極表面部分被免疫復合體堵塞的導電通道會恢復，所以響應電流增大。故本實驗選用37 ℃為操作溫度。

pH對免疫傳感器電流響應的影響(如圖4b所示)與溫度對免疫反應影響相類似。pH值過高或過低都不利于抗原-抗體復合體的形成，實驗結果表明該感器的最適反應pH為7.4。

2.2 電極在組裝過程的電化學表征

圖5中曲線1-4是不同的修飾電極在0.1 mol·L-1KCl+2 mmol·L-1PBS (pH7.4)溶液中的循環伏安曲線圖。與玻碳電極相比(線1)，表面修飾一層MWCNT的玻碳電極(線2)充擴散電流明顯增大，在0.3 V處明顯有一對氧化還原峰，這是因為經氧化處理的MWNCT表面含有以羧基、羰基和羥基為主的活性基團。而0.3 V處氧化還原峰是由于羧基在電極上被還原為羥基，又再次氧化成羧基的結果[14]。當金微粒沉積在MWCNT上(線3)，電極的充擴散電流及氧化還原峰都顯著增強，這是因為具有優良導電性Au微粒組裝在MWCNT/GC電極上后，促進了電子轉移。但是當HRP及乙腦疫苗抗體固定在Au/MWCNT修飾的電極表面后(線4)，電極的沖擴散電流明顯減小，這是由于非良導體的抗原及HRP占據并阻斷了部分導電通道，使得電子向電極表面擴散的阻力增大，有效導電面積減小，電流減小。圖5中線5～線7分別為HRP/乙腦疫苗抗體/Au/MWCNT/GC免疫傳感器在含0.1 mmol/L、0.3 mmol/L及0.5 mmol/L H2O2的磷酸緩沖溶液中的循環伏安曲線。從圖中可以明顯觀察到，隨著PBS中H2O2濃度的增加，峰電位移動到約0.4 V，循壞伏安曲線的充擴散電流及氧化還原峰電流值都有一定增強。這是由于MWCNT能促進HRP的直接電子轉移[15]，故充擴散電流、峰電流及峰電位會有不同程度的增大，這證明HRP/乙腦疫苗抗體/Au/MWCNT/GC免疫傳感器對H2O2有良好的電催化還原作用，當H2O2濃度達到0.3 mmol/L時，電流不再明顯增加，因此PBS溶液中含H2O2濃度0.3 mmol/L為最佳濃度。

2.3 免疫傳感器的響應性能和檢出限

由于HRP/乙腦疫苗抗體/Au/MWCNT/GC免疫傳感器中的MWCNT能促進HRP的直接電子轉移，因此，該無電子媒介體的電流型免疫傳感器可用于乙腦疫苗的檢測。為測量傳感器的響應性能和檢出限，在25 ℃下，用免疫傳感器對0.1 mol·L-1KCl+2 mmol·L-1PBS (pH7.4)溶液重復測定7次，設峰電流值的標準偏差為3 μA，將其作為免疫傳感器的噪音值(I0)。記錄免疫傳感器在不同濃度乙腦疫苗標準溶液中的電流強度，計算這些電流與空白磷酸鹽緩沖液的電流之差。結果如圖6a所示，在所測范圍內響應電流與乙腦疫苗濃度對數呈現“S”線性關系，但該傳感器在5.6×10-8～2.2×10-6lg pfu/mL的范圍內保持良好的線性關系(圖6b線1所示)，回歸方程為：△I=0.1407+0.1358 lgC[乙腦疫苗]，r=0.9929，靈敏度72.4 μA/lg pfu/mL/cm2。與HRP/乙腦疫苗抗體/Au/MWCNT /GC電極相比，HRP/乙腦疫苗抗體/MWCNT/GC電極的線性范圍窄 (圖6b線2)，靈敏度低(6.3×10-8-7.2×10-7lg pfu/mL，靈敏度48.5 μA/lg pfu/mL/cm2)。這是因為多壁碳納米管的高比表面積提高了金微粒的負載量，且金微粒很可能是納米或微米級別的，這些微粒具有大的比表面積，從而有效提高了抗體的固定量，金微粒還能有效保持抗體的活性，從而有效促進了電子傳輸，提高了電極的靈敏度。

2.4 免疫傳感器的特異性

實驗考察了腮腺炎疫苗、水痘疫苗和風疹疫苗對乙腦免疫傳感器的響應程度。測量同一批次制備的3支免疫傳感器分別置于含5.0×10-7lg pfu/mL乙腦疫苗的磷酸緩沖溶液中的響應電流，然后向每支免疫傳感器的緩沖溶液中加入一種干擾疫苗，再分別測定其響應電流。實驗結果表明(表1)，含干擾物溶液中的電流響應值與只含乙腦疫苗的磷酸緩沖溶液中的響應電流無顯著性差異，表明該免疫傳感器具有良好的選擇性。

表1 免疫傳感器的特異性

2.5 免疫傳感器的重現性和穩定性

重現性是免疫傳感器的重要性質之一。將一支乙腦免疫傳感器與5.0×10-7lg pfu/mL的乙腦疫苗樣品標準溶液進行7次反應，檢測其電流響應，其標準偏差為16% (n=7)。另外，取七支免疫傳感器，對濃度為5.0×10-7lg pfu/mL的標準溶液樣品進行檢測，結果RSD=7.1% (n=7)，結果表明該免疫傳感器具有良好的重現性。

穩定性是決定免疫傳感器性能好壞的關鍵因素之一，在本實驗中，將制備的HRP/乙腦疫苗抗體/MWCNT/GC電極在4 ℃下干態放置60 d，放置期間每隔10 d對同一濃度的乙腦抗原進行檢測，前30天其響應電流仍能保持初始電流的93.2%，60 d后電流值只有初始電流值的87.4%。通過免疫傳感器在磷酸緩沖溶液中進行的100片段的循環伏安掃描，與初始電流相比，其響應電流丟失3.14%。免疫傳感器具有較好的穩定性，主要是因為碳納米管對金粒子起到能夠較好的分散作用，而乙腦抗體能夠有效的固定在金微粒表面，并保持良好的生物活性。

2.6 回收實驗

將制備的乙腦免疫傳感器用于4批生物制品乙腦疫苗的效價的檢測，回收率為98.17%～106.44%(表2)，表明該傳感器實驗結果與傳統蝕斑法結果基本一致。

表2 乙腦免疫傳感器回收率

綜合上述實驗，可以得出結論多壁碳納米管與金粒子的結合使用可增加乙腦抗體的固定量；且兩者的協同作用有利于電子向傳感器表面的擴散，整個電催化過程無需電子媒介體，因此傳感器制備過程相對簡便，利用碳納米管對辣根過氧化氫酶電子轉移的促進作用，提高傳感器的響應靈敏度。但有效測量范圍還是相對較小，在這方面仍然需要繼續探索。簡而言之，HRP/乙腦疫苗抗體/MWCNT/GC傳感器對乙腦疫苗檢測具有可行性，但在有效測量范圍和靈敏度等方面還需做大量基礎工作。