Th2型細胞因子模式轉換對高級別宮頸上皮內瘤樣病變的影響

季菲，李曉紅，馬蓉，杜蓉，劉艷佳，丁巖

(新疆醫科大學第一附屬醫院婦科，烏魯木齊 830054)

目前公認的高危型(HR)人乳頭瘤病毒(HPV)會導致宮頸癌的發生[1-3]。大多數HPV感染對宿主沒有進一步的不良后果，但有一定比例未經治療的HR-HPV感染會導致高級別宮頸上皮內瘤樣病變(CIN Ⅱ-Ⅲ)和宮頸癌[4-6]。有證據表明宿主全身與局部的細胞介導的免疫反應是感染過程中的決定因素。“免疫反應是通過釋放不同的細胞因子進行，細胞因子會在形成免疫調節的網絡中對合成和作用互相產生影響”。細胞免疫反應是通過T細胞[輔助型T(Th)細胞和細胞毒T細胞]與抗原遞呈細胞合作調節的。細胞因子對感染所引起的免疫反應一般分為免疫刺激(腫瘤抑制)Th1型細胞因子，例如干擾素γ(IFN-γ),腫瘤壞死因子α(TNF-α),白細胞介素2(IL-2)和白細胞介素12(IL-12),這些主要參與細胞介導免疫，Th2型細胞因子(IL-4,IL-5,IL-6,IL-8,IL-10)是對細胞介導反應產生免疫抑制并主要引起體液免疫[7-8]。對Th1型和Th2型細胞因子水平的定性定量分析可以用來判斷人類的多種疾病，其中就包括HPV感染引起CIN的免疫反應[9]。對宮頸病變的患者或者癌癥患者血漿中的細胞因子的研究不多，某些研究只討論一個或者幾個細胞因子，或者只是附帶提及HR-HPV，并未深入進行研究[10-18]。本研究分析處于CIN不同階段的HR-HPV陽性患者的外周血細胞因子模式,并與HR-HPV陽性和陰性對照組相比較。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年7—8月就診于新疆醫科大學第一附屬醫院婦科門診的宮頸細胞學異常女性作為研究對象。獲取宮頸細胞學、組織學和HPV樣本。研究組構成包括33例女性：10例中度異型(CIN Ⅱ)女性，11例重度異型(CIN Ⅲ)女性，12例宮頸癌女性(10例鱗狀細胞癌，2例腺癌)。對照組包括11例無宮頸細胞病變無高危型HPV女性和10例無宮頸細胞病變但高危型HPV測試為陽性的女性。高危型HPV陰性對照組年齡為32.4歲(病情穩定6.2年)，高危型HPV陽性對照組27.9歲(病情穩定7.4年)，CINⅡ患者33.4歲(病情穩定5.7年)，CINⅢ32.3歲(病情穩定5.5年)，浸潤癌女性35.6歲(病情穩定7.2年)。納入標準:中度異型(CIN Ⅱ),重度異型(CIN Ⅲ),或者微小浸潤癌。排除標準:患者已絕經、取樣時妊娠、患有慢性病(糖尿病、過敏或者自身免疫性疾病)、取樣時有急性感染跡象、免疫力低下。除了口服避孕藥之外，患者沒有定期服用藥物。在取樣前至少2周患者沒有使用止痛藥(非甾體類抗炎藥),CIN Ⅰ級病變(輕度異型)女性排除在外。研究對象中，超過50%的CINⅠ患者為HR-HPV陰性。對照組：在我院婦科門診常規體檢的健康女性。本研究方案經過我院倫理委員會批準，所有女性都已簽署知情同意書。

高危型HPV感染患者和子宮頸細胞病變與高危型HPV陰性和高危型HPV陽性對照組的HPV類型見表1。各組白細胞數目見圖1。

注：與CINⅡ比較，aP<0.05，bP<0.01;與CINⅢ比較，cP<0.01

圖1高危型HPV感染患者和子宮頸細胞病變與高危型HPV陰性和高危型HPV陽性對照組的白細胞數目

1.2 HPV取樣和測定 用于檢測人乳頭瘤病毒和其類型的宮頸刮片采用宮頸生物采樣器(瑞典馬爾默市Medscand Medical公司Accellon Combi?)采集。HPV測試如前面所述是通過對37個子類共同引物GP5/GP6聚合酶鏈式反應(PCR)酶免疫分析法進行[19-20]。用β球蛋白PCR來識別樣本錯誤并監控PCR抑制物。另外，PCR酶免疫分析陽性案例中使用反向線點分析來識別個人的HPV類型。

表1 子宮頸細胞病變患者(CINⅡ,CINⅢ和癌)和HR-HPV陽性對照組的HPV類型

注：CIN為宮頸上皮內瘤；HPV為人乳頭瘤病毒；下表同

1.3 血液取樣及處理 用不含無菌內毒素的真空抽血管( 法國，Meylan,Becton Dickinson)采集早上8點到中午12點外周小靜脈血液樣本,用乙二胺四乙酸作為抗凝血劑，血漿樣本在化驗前在-80 ℃下保存。用Sysmex XE-2100在所有的血液樣本中測出的白細胞數目均不同。

1.4 細胞因子測定 所有的血漿樣本都用酶聯免疫測定試劑盒(比利時尼韋爾,歐洲Biosource生產)來測定細胞因子TNF-α,可溶性TNF-α受體(sTNFR I和sTNFRⅡ),IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-10和IL-12[21]。IL-12免疫檢定中的檢測抗體能識別活性異二聚體(p40+p35)細胞因子，還有p40亞基同型二聚體。

CINⅢ患者和宮頸癌患者的血漿IFN-γ濃度顯著低于CINⅡ患者或者對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 高危型HPV陽性宮頸細胞病變患者和高危型HPV陰性和高危型HPV陽性對照組IFN-γ血漿濃度(pg/106)

注：IFN-γ為干擾素γ；下表同

TNF-α的血漿濃度在組之間差別并不大，差異無統計學意義(P>0.05)，但在CIN Ⅲ患者和宮頸癌中，TNFRⅡ的血漿濃度明顯低于CIN Ⅱ，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 高危型HPV陽性宮頸細胞病變患者和HPV陰性及HPV陽性對照組的血漿TNF-α濃度及其可溶性受體sTNFRI和sTNFRII

注： TNF-α為腫瘤壞死因子α；sTNFRⅠ為可溶性腫瘤壞死因子受體I；sTNFRⅡ為可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ

1.5 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件數據處理，用Spearman等級檢驗來調查細胞因子變量之間的相關性。選雙尾P值0.05來表示差異性。用非成對雙尾t測試來測定白細胞和白細胞亞群的差異。

2 結果

2.1 HPV測定結果 HPV類型16、18、31是最常檢測到的高危型HPV類型(n=18，n=7，n=8)。HPV-33，n=2；HPV-35，n=1；HPV-39，n=2；HPV-45，n=1；HPV-51，n=1；HPV-52，n=2；HPV-56，n=6；HPV-58，n=1；HPV-59，n=2；HPV-82，n=1。在1例CIN Ⅲ女性中檢測到HPV-70(低危型)及HPV-16，該女性成為12例女性中唯一只是單一感染患癌的個體。計有34例單一HPV感染，8例多重HPV感染的個體。表1匯總了研究組中的HPV類型。白細胞計數差別：CINⅢ和癌癥患者的白細胞總數比CINⅡ患者和對照組高，CINⅡ和CINⅢ的白細胞數差別巨大。中性白細胞數也顯示了類似的變化曲線，從CINⅡ到癌癥有顯著增加。各組的絕對單核細胞和淋巴細胞計數差別巨大，CINⅢ女性患者數值最高。圖1顯示了白細胞計數差別。

2.2 細胞因子水平 細胞因子化驗結果是基于每一個106白細胞，以對各研究對象不同數目的細胞因子產生白細胞進行分層。通過對研究組外周血細胞因子水平的分析，本組發現了8個所調查的細胞因子每一個變化曲線都不同。各組的差別表現在IFN-γ濃度上，從CINⅡ到CINⅢ到癌癥(P≤0.01)有顯著減少，如表3匯總所示。

對照組和研究組的血漿TNF-α濃度差異無統計學意義。兩種TNF受體在所有的組中都有顯著的關聯性(高危型HPV陰性對照組r=0.973，P<0.001；高危型HPV陽性對照組r=0.855，P=0.002；CINⅡ患者r=0.979，P=0.001；CINⅢ患者r=0.791，P=0.004；侵入性癌患者r=0.748，P=0.005)。TNFRⅡ數在高危型HPV陽性對照組中最高。宮頸癌患者的TNFRⅡ數比CINⅡ患者有顯著減少。TNFRⅠ也顯示了類似的模式，不過差異不顯著。

高危型HPV陰性到高危型HPV陽性對照組血漿IL-2濃度有顯著增加(P=0.037)，不過IL-2數沒有顯著變化。各組的IL-12沒有顯著差別。在大多數被調查的血漿樣本中，IL-4濃度低于檢測極限值。在大多數對照組女性和中度異型女性中，IL-10值低于檢測極限值，不過在11例CINⅢ女性中4例能檢測到，在12例浸潤癌患者中7例能檢測到。表4標出了IL-4和IL-10數據。

表4 高危型HPV陽性宮頸細胞病變患者、高危型HPV陰性和陽性對照組IL-4及IL-10血漿濃度

注：IL-4檢測極限值，2 g/L；IL-10檢測極限值，1 g/L

在所有的研究組中，通過計算Th1型細胞因子IL-12，IFN-γ，TNF-α，IL-2與Th2型稀薄因子IL-10的比率，本組得出癌癥患者Th2型細胞因子可能有所增加。癌癥患者的該比率與高危型HPV陽性對照組或者CINⅡ患者相比顯著減少(IFN-γ與IL-10比率P<0.01,TNF-α與IL-10比率P=0.02及P<0.01,IL-2與IL-10比率P=0.03及P=0.06)。圖2標出了IL-12與IL-10的比率作為例子。

圖2 宮頸細胞病變HPV陽性患者和高危型HPV陰性和高危型HPV陽性對照組血漿中IL-12與IL-10的比率

3 討論

患者的白細胞計數差別與Onsrud等[22]研究結果一致，Onsrud指出宮頸癌時，可能是由于炎癥或者壞死造成白細胞和中性細胞數目增加，與健康的對照組相比，淋巴細胞絕對值有所減少。Gemignani等[23]和Balaram等[24]的研究也確認了這些結果。這為每106白細胞細胞因子數據的分層作出了解釋。本研究表明重度異型和浸潤癌癥女性中流動IFN-γ濃度有顯著減少。IFN-γ是Th1細胞、細胞毒T細胞、刺激后的自然殺傷細胞分泌的，在對HPV感染作出有效Th1型細胞免疫反應中發揮主要作用?？蓹z測到的IFN-γ的產生可能與持續的HPV感染和HPV相關腫瘤發生有關系[25]。本組的流動IFN-γ數據與此類報告一致。TNF-α與IFN-γ在導致宮頸癌細胞凋亡或者壞死中協同發揮作用[26]。TNF-α的生物學作用由其兩個受體TNFRⅠ和TNFRⅡ介導。這兩個受體在很多細胞類型和組織中都存在；TNFRI 在對TNF-α毒性作用敏感的細胞中非常多見，而TNFRⅡ在刺激后的T和B細胞中非常多見[27]。包括TNF-α本身，一些細胞因子對兩種受體的細胞表面反應通過對細胞外區域進行蛋白質裂解成為可溶性蛋白sTNFRⅠ和sTNFRⅡ流出，進入循環系統。對這兩種可溶性受體，特別是sTNFRⅡ的檢測通常用來評估Th1型細胞在細胞介導免疫反應中的行為[27-29]。本研究發現各組的TNF-α值沒有顯著區別。不過，癌癥患者血漿中這兩種可溶性受體濃度有所減少，sTNFRⅡ則顯著減少。該結果反映了發展為CINⅢ和浸潤癌后，流動TNF-α減少，Th1型免疫反應被擾亂。在本研究組中，外周血Th1型細胞因子IL-2濃度除了從高危型HPV陰性到高危型HPV陽性對照組有些許增加(P=0.037)之外沒有顯著區別，該增加可能顯示了對病毒性感染的抗感染反應?！鞍准毎樗?0濃度隨著異生的嚴重性而顯著增加”。在宮頸癌發展過程中可能轉化成Th2型細胞因子，這可能表現在血漿中Th2型細胞因子IL-4和IL-10濃度增加。不過，在研究組中沒有發現IL-4濃度有顯著區別。IL-10濃度隨著宮頸上皮內瘤樣病變的程度而顯著增加。IL-10是有效的免疫抑制細胞因子，其抑制T細胞活性和Th1細胞分化。Jacobs等[18]將向Th2型的轉化描述為高級別鱗狀上皮內病變患者 IL-12與IL-10比率顯著減少。IL-12是誘導細胞介導免疫的關鍵細胞因子，其促使T細胞分化成IFN-γ，產生Th1細胞，促使自然殺傷細胞產生IFN-γ。在本研究中發現的CINⅢ患者和癌癥患者IL-12,IFN-γ，TNF-α和與IL-10相關的IL-2顯著減少，支持并延伸了Jacobs等[18]在重度宮頸異生和宮頸癌發展時擾亂的細胞免疫反應的發現。在所有的參與者中，本組排除了能夠影響循環細胞因子濃度的疾病，所以本組推定這些結果是HPV感染的后果。本組發現從異型到浸潤癌的不同階段的循環中的干擾素γ和腫瘤壞死因子α受體Ⅱ有顯著減少，白細胞介素10濃度增加。這些結果顯示宮頸上皮內瘤(CIN)Ⅲ 病變女性宮頸癌癌變過程中向輔助性T2型(Th2)細胞因子轉化，在治療CINⅡ和CINⅢ患者時進行預防接種，使Th2型反應轉化為Th1型反應可能有效果。本組發現的宮頸異型和浸潤癌外周細胞因子轉化不一定跟公布的細胞因子數據一致[10-18]。在Niwa等[10]的研究中，宮頸癌患者和對照組血漿中IFN-γ濃度相似，而在Lebrecht等[11]的研究中，在所有的組中IFN-γ濃度均低于檢測極限值。本組血漿TNFRI濃度發現宮頸癌患者與良性病變子宮肌瘤女性相比，血清sTNFRI濃度非常低。不過這與Malejczyk等[16]的結果不同，在其研究中，HPV-16關聯的CINⅠ/Ⅱ和CINⅢ病變、HPV-16/18相關的鱗狀細胞宮頸癌患者與健康對照組進行了比較。CIN病變女性和對照組在受體數值上沒有顯著差別，不過兩種受體濃度在宮頸癌患者中有顯著增加。造成與此前研究結果不同的重要因素包括對照組和患者的選擇標準。在本研究中，根據他們感染高危型HPV的狀態選擇患者和對照組。1例宮頸癌女性為低危型HPV70的個案可以解釋為高危型HPV DNA通過細胞基因組L1區域進行結合，這在GP5+/6+ PCR中可能被遺漏。除了Jacobs等[18]和Malejczyk等[16]的研究之外，上面所提到的研究中都沒有研究HPV的存在。而且，白細胞數的分層可能也能解釋這些不一致之處。免疫活性白細胞是循環細胞因子的主要產生來源。與其他研究相比，本研究是根據白細胞數計算結果的，而不是根據每毫升血漿。最后，細胞因子檢測的分析方法可能不一樣。有些研究用血漿，有些研究用血清，這種選擇可能會影響數據結果。有些研究都使用酶聯免疫測定試劑盒，有些由不同的廠家生產。這說明使用不同的抗體系統來粘合細胞因子并量化其敏感度不一。本研究結果顯示CINⅢ病變女性中向Th2細胞因子模式轉換已經很明顯。這為臨床治療所有CINⅢ病變女性的原則提供了理論基礎。另外，這也可能表明，宮頸癌患者預防接種可能使Th2型反應轉為Th1型反應，這在CINⅡ病變女性中可能也有一定的作用。

總之，本研究表明了不同階段的宮頸上皮內瘤樣病變到發展為浸潤癌的過程中高危型HPV感染的外周細胞環境的特征性變化： IFN-γ和sTNFRⅡ顯著減少，IL-10濃度增加。這表明在宮頸癌發展過程中模式向Th2型免疫反應轉化。在CINⅢ患者中細胞介導免疫表現明顯，這和大多數CINⅢ病變如果沒有正規治療，并不會自動減輕，而可能最終發展為浸潤癌的臨床觀點一致[30]。