基于ROS—MAPK信號通路探討桃葉珊瑚苷抗心肌纖維化作用

羅麗芳 李青 蔡立婧

[摘要] 目的 研究桃葉珊瑚苷（AU）對血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）誘導的大鼠心肌成纖維細胞（CFs）增殖的影響及作用機制。 方法 采用胰酶消化法及差速貼壁法培養大鼠CFs，實驗分為空白對照組、Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）干預組、低濃度AU干預組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（1 μmol/L）]、中濃度AU干預組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（10 μmol/L）]、高濃度AU干預組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（100 μmol/L）]。用CCK8法測定細胞增殖活性，酶聯免疫吸附法（ELISA）測定細胞上清中Ⅰ、Ⅲ型膠原含量，熒光酶標儀檢測活性氧（ROS）水平，Western blot法檢測p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達。 結果 與Ang Ⅱ干預組比較，中、高濃度AU干預組CFs增殖和p38MAPK磷酸化被明顯抑制（P < 0.05）。與Ang Ⅱ干預組比較，低、中、高濃度AU干預組ROS、Ⅰ、Ⅲ 型膠原的生成明顯減少（P < 0.05）。 結論 AU可通過ROS-MAPK通路途徑抑制Ang Ⅱ誘導的CFs增殖和膠原生成。

[關鍵詞] 桃葉珊瑚苷；心肌成纖維細胞；增殖；活性氧；p38絲裂原活化蛋白激酶

[中圖分類號] R541.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（b）-0014-04

Anti myocardial fibrosis effects of aucubin based on ROS-MAPK signaling pathway

LUO Lifang LI Qing CAI Lijing

Department of Pharmacy， Jiangxi Provincial People′s Hospital， Jiangxi Province， Nanchang 330006， China

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of aucubin （AU） on cardiac fibroblasts （CFs） proliferation induced by angiotension Ⅱ （Ang Ⅱ）. Methods Rat CFs were cultured by the methods of trypsin digestion and differential adhesion. They were divided into blank control group， Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） intervention group， low concentration of AU intervention group [Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） + AU （1 μmol/L）]， medium concentration of AU intervention group [Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） + AU （10 μmol/L）]， high concentration of AU intervention group [Ang Ⅱ （1×10-6 mol/L） + AU （100 μmol/L）]. CCK8 method was used to test cell proliferation activity， collagen type Ⅰ， Ⅲ content in cell supernatant were determed by enzyme linked immunosorbent （ELISA）， fluorescence enzyme standard instrument was used to detect reactive oxygen species （ROS） level， Western blot method was used to detect p38MAPK and p-p38MAPK protein expression. Results Compared with Ang Ⅱ intervention group， CFs proliferation and p38MAPK phosphorylation were significantly inhibited in the medium and high concentration AU intervention groups （P < 0.05）. Compared with Ang Ⅱ intervention group， low， medium and high concentration of AU intervention group ROS， the production of collagen type Ⅰ， Ⅲ decreased significantly （P < 0.05）. Conclusion AU can restrain by ROS-MAPK pathway Ang Ⅱ induction of CFs proliferation and collagen formation.

[Key words] Aucubin； Cardiac fibroblasts； Proliferation； ROS； p38MAPK

目前，心血管疾病已嚴重威脅我國居民健康，由其引發的死亡率已位居總死因的首位[1-2]。眾多心血管疾病不斷進展的共同結局是心肌纖維化，可使室性心律失常頻發及血流動力學異常，最終導致死亡。抑制或逆轉心肌纖維化成為治療多種心臟疾病的最關鍵的一步[3-4]。桃葉珊瑚苷（aucubin，AU）屬環烯醚萜苷類化合物，主要存在于忍冬科、車前科、杜仲科植物中，是一種重要的生物活性物質，具有抗病毒、抗炎、抗氧化等多種藥理作用[5-7]。研究[8]表明，AU及苷元能清除DPPH自由基、超氧陰離子等自由基，對PCI2細胞氧化損傷具有保護作用。最新研究[9]發現，桃葉珊瑚苷可能通過抑制活性氧（ROS）介導的MAPK通路的激活來延緩肝臟纖維化的發生發展。基于上述研究，本研究探討AU抗心肌纖維化的作用，并探討其作用機制與ROS-MAPK信號通路的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新生（2 d齡）雄性SD大鼠，體重（8.5±1.2）g，由南昌大學動物科學部提供，合格證號：SYXK（贛）2015-0001。飼養條件：新生大鼠和母鼠同放在金屬飼養籠中，室溫（24±1）℃，人工照明12 h/d（7：00～19：00），自由飲食及飲水，新生大鼠由母鼠喂養。

1.1.2 藥品與試劑 桃葉珊瑚苷標準品（成都曼思特生物科技有限公司，批號：20161123），血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ，美國Sigma公司，批號：A9525），DMEM高糖培養基（凱基生物有限公司，批號：20150318），CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（全式金，批號：#J20705），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批號：20170413），BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：20170524），小鼠抗p38 MAPK（美國Santa Cruz公司，批號：B1655）、磷酸化p38 MAPK（p-p38 MAPK）抗體（美國Santa Cruz公司，批號：B1643），兔抗波形蛋白（Vimentin）抗體（美國Santa Cruz公司，批號：B1607），ROS檢測試劑盒（碧云天生物技術公司，批號：S0033），Ⅰ型膠原檢測酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海拜力生物科技公司，批號：20170303）、Ⅲ型膠原檢測ELISA試劑盒（上海拜力生物科技公司，批號：20160224）。

1.1.3 主要儀器 迷你雙垂直電泳儀，迷你轉印電泳儀（北京六一儀器廠）；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；自動酶標儀（Bio Tek Synergy H1）。

1.2 實驗方法

1.2.1 心肌成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）的獲得與培養 將出生2 d的SD大鼠在75%乙醇中浸泡數秒，對其頸部以下進行消毒，開胸取出大鼠心臟，用磷酸鹽緩沖液（含雙抗）清洗3次，并剪碎。依次加入0.01% Ⅱ型膠原酶、0.06%胰蛋白酶消化5 min，收集上清液，重復消化2次，收集懸浮液，1000 r/min，5 min離心過濾后留取沉淀物，置于37℃ CO2恒溫培養箱中。采用差速貼壁法分離培養出CFs，經免疫組化染色（Vimentin陽性）鑒定證實為CFs，待CFs細胞生長融合時傳代，3～4代細胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組 實驗分為空白對照組、Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）干預組、低濃度AU干預組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（1 μmol/L）]、中濃度AU干預組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（10 μmol/L）]、高濃度AU干預組[Ang Ⅱ（1×10-6 mol/L）+AU（100 μmol/L）]。細胞長至融合狀態時，給予相應措施。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖情況 將細胞均勻接種至96孔板內，置于溫箱培養24 h后將培養基更換為1%血清的培養基饑餓12 h，各組采用相應措施干預36 h后，將培養基換為含有10 μL CCK-8的無血清培養基100 μL，置于37℃孵育2 h，使用ELISA檢測儀檢測A450值。

1.2.4 ELISA法檢測上清液中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量 將培養細胞用胰酶消化后計數，以1000個/孔接種至24孔培養板孔內。待細胞長至70%～80%融合時，加入含1%血清的培養基饑餓12 h后加入不同處理因素的培養基，36 h后收集上清液。按照試劑盒說明書進行檢測。各組細胞的上清液分別加入包被了抗大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體的96孔板，溫育2 h后洗滌，加入酶標抗體工作液和顯色液，終止反應后使用酶標儀（波長490 nm）測定OD值，根據標準曲線，算出各組Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量。

1.2.5 ROS的測定 根據試劑盒說明書進行檢測。將各組干預后的細胞用PBS洗滌2～3次，并加入1 mL DCFH-DA稀釋液（10 μmol/L），孵育20 min，無血清DMEM培養基洗滌3次，在酶標儀下觀察熒光（485 nm為激發波長，525 nm為發射波長）。ROS水平（%）=干預組熒光值/空白對照組熒光值×100%，將空白對照組設為參考值100%，其余組ROS水平與之對比即得出相對ROS水平。

1.2.6 Western blot法檢測p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表達 各組細胞加入組織裂解液，4℃，裂解30 min，10 000 r/min離心10 min，吸取上清，即可獲得總蛋白。按照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度。蛋白變性后上樣，于濕轉槽內將蛋白轉印至PVDF膜，經一抗（1∶1000）4℃孵育過夜后，二抗（1∶2000）溶液中室溫孵育1～2 h。加入適量ECL曝光液，在凝膠成像系統中曝光。用Quantity One軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0對所得數據進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AU對Ang Ⅱ誘導的大鼠CFs增殖的影響

Ang Ⅱ干預組的OD值較空白對照組明顯升高（P < 0.05）；低濃度AU干預組CFs增殖活性比Ang Ⅱ干預組略低，但差異無統計學意義（P > 0.05）。中、高濃度AU干預組CFs增殖活性均明顯低于Ang Ⅱ干預組（P < 0.05），且呈劑量依賴性。見圖1。

2.2 AU對Ang Ⅱ誘導的大鼠CFs產生Ⅰ、Ⅲ型膠原的影響

Ang Ⅱ干預組的膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ含量較空白對照組明顯升高（P < 0.05）；低、中、高濃度AU干預組的膠原蛋白Ⅰ和Ⅲ的生成均被顯著抑制（P < 0.05）。見表1。

2.3 AU對Ang Ⅱ誘導的大鼠CFs產生ROS的影響

與空白對照組比較，Ang Ⅱ干預組CFs的ROS水平明顯升高（P < 0.05）；低、中、高濃度的AU呈濃度依賴性地抑制ROS的產生（P < 0.05）。見圖2。

2.4 AU對p38MAPK蛋白磷酸化的影響

與空白對照組比較，Ang Ⅱ干預組細胞中p-p38/p38比例明顯升高（P < 0.05）。與Ang Ⅱ干預組比較，低濃度AU干預組的細胞p-p38/p38比例輕微下降，但差異無統計學意義（P > 0.05），而給予中、高濃度AU干預組的細胞p-p38/p38比例相較于Ang Ⅱ干預組出現明顯的降低（P < 0.05）。見圖3。

3 討論

心肌纖維化的病理表現為心肌組織結構中膠原纖維過度沉積及各型膠原比例失調且排列紊亂[10]。研究[11]發現，CFs的異常增殖及大量的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的沉積是心肌纖維化的重要原因。目前，產生ECM的CFs成為藥物治療心肌纖維化的重要靶標。本研究探討了AU對Ang Ⅱ誘導的CFs增殖和細胞外基質表達的影響。本研究結果顯示，AU能呈濃度依賴性地抑制Ang Ⅱ誘導的CFs增殖和Col Ⅰ和Col Ⅲ的分泌，提示AU可通過抑制CFs的增殖和減少ECM沉積來抑制心肌纖維化。

ROS是氧化系統中產生的不穩定、高活性氧分子化合物的統稱，主要包括含氧自由基、氧的非自由基衍生物、氫過氧化物等，它可調節細胞的增殖和凋亡[12-13]。ROS己被證實為心肌纖維化形成和進展的重要因素之一。研究[14-15]表明，ROS在CFs增殖和細胞外基質沉積過程中起著重要作用。本研究結果顯示，AU在抑制CFs增殖和下調Col Ⅰ和Col Ⅲ水平的同時，ROS生成也顯著下降，提示抑制ROS的生成是AU抑制CFs增殖和下調Col Ⅰ和Col Ⅲ水平的的主要機制之一。

MAPK信號通路是介導刺激信號從細胞膜傳遞到細胞核內并作出反應的一個主要系統[16]。MAPK家族的信號通路主要有3組：外信號調節激酶（extra -cellular signal-regulated kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）和p38-MAPK，均參與了心肌纖維化的發生發展[14]。研究[17]表明ROS的產生可激活MAPK信號通路，誘導CFs增殖和ECM過度沉積，從而導致心肌纖維化的發生發展。本研究結果顯示，AU在抑制ROS的生成的同時，抑制了p38-MAPK的激活，提示AU可通過抑制ROS-p38MAPK通路來抑制CFs的增殖和細胞外基質的生成。

眾多研究[18-20]表明，中藥對心肌纖維化具有良好的療效，如：野黃芩苷、橙皮素和柚皮苷等。本研究提示，AU可通過抑制ROS-MAPK通路的激活，有效地抑制Ang Ⅱ誘導的CFs的增殖和ECM的生成，這一結論為研發以AU為基礎的抗心肌纖維化藥物提供了理論依據。

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（收稿日期：2018-09-26 本文編輯：金 虹）