發酵香草蘭豆莢主要風味成分及其前體物與蛋白的變化①

蔡瑩瑩 陳星星 谷風林 徐 飛

(1華中農業大學食品科學技術學院 湖北武漢 430070；2中國熱帶農業科學院香料飲料研究所 海南萬寧 571533；3國家重要熱帶作物工程技術研究中心 海南萬寧 571533；4海南省熱帶香料飲料作物工程技術研究中心 海南萬寧 571533)

香草蘭(Vanilla planifolia Andrews)又名香莢蘭，原產于墨西哥，典型的熱帶蘭科作物，被譽為“食品香料之王”[1]。它是食品、飲料和化妝品中最重要和最受歡迎的芳香植物之一[2-3]。香草蘭的鮮豆莢沒有特別的香味，但在經過殺青、發汗、干燥、陳化4個階段的發酵，在陳化豆莢中會產生特有的香氣。目前關于香草蘭的發酵生香機理還不是很清楚，一般認為香草蘭中的風味物質是在葡萄糖苷酶、過氧化物酶、多酚氧化酶、果膠酶、纖維素酶等酶的作用下由風味前體物水解而形成[4]。此外，由于豆莢在發酵過程中一直與外界環境相接觸，這就不可避免豆莢上有微生物的生長，而微生物的生長必然會產生大量的代謝產物，這些都影響到了風味物質的形成[5-6]。關于微生物可能參與發酵生香有大量報道，比如General等研究表明，從香草蘭豆莢上分離到的由酵母分泌的糖苷酶能夠將阿魏酸轉化為香草酸等其他多種化合物[7]。因此內源酶和微生物對香草蘭的發酵生香都起著很重要的作用。對于不同產地和品種的香草蘭豆莢目前已經鑒定出460種以上的揮發性成分，主要包括芳香酯、醛類、酚類、酮類、脂肪酸等[8-10]，其中香蘭素、香草酸、對羥基苯甲醛、對羥基苯甲酸等物質含量較高，對香味的貢獻也較大[11]。在課題組前期的研究中發現這些風味成分的前體物主要是L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、阿魏酸、葡萄糖、咖啡酸、肉桂酸、對香豆酸、松柏醇等[12]。此外鮮豆莢經過殺青之后其生命活力已經停止，細胞和組織結構受到破壞，蛋白在這個過程中可能發生了變化，并且蛋白也可能參與了酶促氧化和非酶氧化。

香草蘭豆莢中的風味成分及其前體物在發酵過程中不斷消耗和生成，但是對于主要風味物質在發酵過程中哪個階段形成，以及在發酵過程中是如何進行累積的，還不是很清楚。因此，本文采用LC-MS/MS方法探究香草蘭發酵過程中主要物質及其糖苷前體物的消長規律，并且采用電泳方法探究蛋白的變化，為完善生香加工技術，提高豆莢質量提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材

不同發酵階段的香草蘭豆莢(鮮豆莢(FVB)，殺青豆莢(BVB)，發汗豆莢(SVB)，干燥豆莢(DVB)，陳化豆莢(CVB))由中國熱帶農業科學院香料飲料研究所提供。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈、乙醇購自Merck公司，均為色譜純。尿素、碘乙酰胺、硫脲、維生素C、十二烷基磺酸鈉、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙硫酸(CHAPS)、二硫蘇糖醇、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨購自Sigma(St．Louis， MO， USA)。 DNA提取酚試劑購自Solarbio，瓊脂糖、24 cm IPG膠條(pH3-10)購自GE Healthcare(Uppsala，Sweden)。丙烯酰胺、交聯聚乙烯吡咯烷酮、甲叉雙丙烯酰胺購自Bio-Rad Labs(Richmond，CA，USA)。其余藥品試劑：丙酮、硫酸銨、乙酸、蔗糖、硼砂、甘油、甲醇、磷酸、乙醇等購自北京化學試劑廠，均為分析純。

1.1.3 儀器設備

研磨儀(MM 400，Retsch)， 超高效液相色譜(Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A)，串聯質譜(Applied Biosystems 6500 QTRAP)，高速冷凍離心機(Eppendorf centrifuge 5810R，德國)， 島津紫外分光光度計(UV-2450，日本)， 恒溫搖床(C25kc，美國)， 等電聚焦儀Ettan IPGphor 3(GE Healthcare)，垂直電泳儀Ettan DALTtwelve(GE Healthcare)，Image ScannerⅢ投射掃描儀(GE Healthcare)等。

1.2 方法

1.2.1 代謝物樣品的提取和定量

(1)樣品提取

不同發酵階段的香草蘭豆莢經真空冷凍干燥后利用研磨儀研磨(30 Hz，1.5 min)至粉末狀；然后分別稱取100 mg的粉末，加入1.0 mL 70%的甲醇水溶液，4℃冰箱過夜，期間渦旋3次，提高提取率；最后將樣品在4℃以10 000 g的轉速，離心10 min分鐘，吸取上清液，并用0.22 μm的微孔濾膜過濾后，用于LC-MS/MS分析。

(2)色譜質譜采集條件

a.液相條件主要包括：色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm， 2.1 mm×100 mm；流動相：水相為超純水(加入0.04%的乙酸)，有機相為乙腈(加入0.04%的乙酸)；洗脫梯度：0 min水/乙腈(95∶5 V/V)， 11.0 min為 5∶95 V/V， 12.0 min為 5∶95 V/V， 12.1 min為 95∶5 V/V， 15.0 min為95∶5 V/V；流速0.4 mL/min；柱溫40℃；進樣量 2 μL。

b.質譜條件主要包括：電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)溫度500℃，質譜電壓5 500 V， 簾氣(curtain gas，CUR)25 psi，碰撞誘導電離(collision-activated dissociation，CAD)參數設置為高。在三重四級桿中，每個離子對是根據優化的去簇電壓(declustering potential，DP)和碰撞能(collision energy，CE)進行掃描檢測，具體參數如表1。

表1 質譜檢測參數[13]

(3)代謝物定性與定量

基于 MassBank， KNAPSAcK， HMDB， MoTo DB，METLIN和別的已經存在的代謝物信息公共數據庫，根據二級譜信息進行物質定性，獲得不同樣本的代謝物質譜分析數據后，對所有物質質譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質譜出峰進行積分校正[14]。

1.2.2 蛋白的提取和定量

參考Saravanan等[15]的方法進行蛋白的提取，并加以調整。稱量2 g的香草蘭豆莢粉末加入10 mL BPP蛋白提取液[2%2-巰基乙醇(V/V)、EDTA100 mmol/L， 30%蔗糖(m/V)、 Tris 10 mmol/L， 維生素 C 50 mmol/L、 硼砂 50 mmol/L、 1%Triton-100(V/V)、 1%PVPP(m/V)，pH 8.0]，在室溫下渦旋混勻10 min后加入7 mL的DNA提取酚試劑，室溫渦旋10 min，離心(4℃，15 000×g)15 min。將上層酚相轉移至另一新的離心管中，加入等體積BPP蛋白提取液，室溫渦旋5 min，離心(4℃，15 000×g)15 min。小心吸取上層清液與5倍體積預冷的過飽和硫酸銨甲醇溶液混勻后，-20℃沉淀6 h以上。懸浮液離心(4℃，15 000×g)15 min后，收集沉淀。沉淀用預冷的甲醇洗滌2次，隨后用預冷的丙酮洗滌2次，室溫干燥后溶解于蛋白裂解液(2 mol/L硫脲，7 mol/L尿素，13 mmol/L DTT，2%CHAPS)中，-20℃保存備用。蛋白質定量參考Bradford法[16]，用牛血清蛋白(BSA)作為標準品，在紫外分光光度計上進行蛋白濃度測定。

1.2.3 電泳

(1)SDS-PAGE電泳

二維凝膠電泳(1-DE)：主要采用不連續膠SDS-PAGE法[17]，用4%濃縮膠和12.5%分離膠進行電泳分離，蛋白上樣量為30 μg，電泳參數設置為7 W/gel 2 h。

(2)雙向電泳

二維凝膠電泳(2-DE)：第一向等電點聚焦在Ettan IPGphorⅡ等電聚焦儀上完成。使用24 cm的pH 3-10線性IPG干膠條，每根膠條上樣量為1 500 mg蛋白，上樣體積455 uL，常溫水化18 h，每根膠條上覆蓋5 mL礦物油防止樣品揮發。聚焦程序設定為： 250 V， 3 h； 500 V， 2 h； 1 000 V， 1 h；8 000 V，3 h；8 000 V下進行110 000 Vhrs聚焦，每根膠條限流50 μA。第二向電泳前進行膠條平衡，將聚焦好的膠條放入平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl， pH 8.8， 2%SDS， 30%甘油， 6 mol/L 尿素，0.02%溴酚藍)中平衡，先后浸泡在1%DTT的膠條平衡液和含4%碘乙酰胺的膠條平衡液中，各15 min。平衡結束后，轉移膠條垂直放于12.5%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)的上端，用含有適量溴酚藍的1%瓊脂糖封住膠條，保證膠條與凝膠充分接觸，在Ettan Daltsix電泳儀中進行電泳，電泳參數設置為5 W/gel 1 h， 7 W/gel 3.5 h。

(3)凝膠染色及圖像采集分析

凝膠染色主要采用考馬斯亮藍(G-250)染色液進行染色[18]。脫色干凈的凝膠采用Image ScannerⅢ掃描儀進行掃描。

1.2.4 數據分析

實驗數據用Excel 2016進行均值計算及繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同發酵階段的香草蘭豆莢主要前體物與風味成分的動態變化

2.1.1 主要風味前體物的動態變化

(1)L-苯丙氨酸

如圖1-A1所示，L-苯丙氨酸隨著發酵的進行含量逐漸增加，發汗階段達到頂峰，進一步發酵時含量降低，說明L-苯丙氨酸轉化為風味成分可能主要在干燥和陳化階段。酶對L-苯丙氨酸的轉化為香蘭素起著重要的作用。人們普遍認為香蘭素是L-苯丙氨酸經過苯丙烷途徑的產物，并且芳香環的4位羥基是通過細胞色素P450酶和肉桂酸羥化酶的作用而產生[19]。并且由于豆莢在發酵過程中一直與外界環境相接觸，因此微生物可能參與了L-苯丙氨酸的轉化，有研究表明幾種白腐真菌和變形桿菌具有苯丙氨酸氨裂解酶活性，苯丙氨酸在苯丙氨酸氨裂解酶的作用下脫氨基成反式肉桂酸，進一步形成香蘭素的前體如松柏醇，阿魏酸和松柏醛，最終形成香蘭素[2]。

(2)L-酪氨酸

如圖1-A2所示，L-酪氨酸在殺青階段含量最高，可能是由于殺青時豆莢的細胞組織受到破壞，使得其他與酪氨酸以結合形式存在的物質發生了水解或轉化，釋放了酪氨酸，也可能來源于蛋白的降解。在發汗、干燥、陳化階段含量逐漸降低，說明L-酪氨酸可能主要在發汗、干燥、陳化階段參與風味成分的轉化。由于豆莢在發酵過程中一直與外界環境相接觸，也可能有多種微生物參與了L-酪氨酸的轉化。

(3)阿魏酸

如圖1-A3所示，阿魏酸在殺青階段含量有所增加，可能是由于殺青時豆莢的組織結構被破壞，使得以結合形式存在于細胞壁的阿魏酸糖苷與酶接觸，通過酶解作用釋放游離的阿魏酸，使得阿魏酸的含量有所增加[20]。然而在發汗階段阿魏酸的含量有所下降，說明阿魏酸轉化為風味物質可能主要發生在發汗階段。發汗使得殺青后的豆莢快速脫水干燥，避免后續發酵過程中霉菌的生長。此外，這個階段提高處理溫度，酶活性被激發，促進了風味前體物的水解[21]。Gallage等[22]研究表明，阿魏酸及其葡糖苷在香草醛合成酶(VpVAN)的作用下可以直接轉化為香蘭素及其葡糖苷。而在干燥和陳化階段阿魏酸的的含量又逐漸升高，可能來自于別的物質的轉化。

(4)葡萄糖

如圖1-A4所示，從鮮豆莢到殺青豆莢葡萄糖的含量逐漸升高，在發汗階段下降，可能是葡糖苷的水解未達到高峰期，并且已經水解的一部分葡萄糖作為底物被反應掉。而在干燥和陳化階段葡萄糖的的含量又逐漸升高，可能是由于隨著發酵的進行，葡糖苷的不斷水解，風味成分和葡萄糖逐漸被釋放出來[19]，葡萄糖的含量逐漸回升，陳化階段達到最高。

(5)咖啡酸和肉桂酸

如圖1-A5和1-A6所示，咖啡酸和肉桂酸在鮮豆莢到發汗豆莢中，隨著發酵的進行，含量逐漸升高，在干燥階段開始下降，陳化階段進一步升高，說明咖啡酸和肉桂酸轉化為風味物質可能主要在干燥階段進行，并且二者之間的含量變化是相關的。Funk和Brodelius研究表明咖啡酸可以通過甲基化生成異-阿魏酸，隨后生成3，4二甲基肉桂酸，該化合物進一步形成香蘭酸，香蘭素[23-25]。

圖1 不同發酵階段香草蘭豆莢風味前體物的動態變化

(6)對香豆酸和松柏醇

如圖1-A7和1-A8所示，從鮮豆莢到干燥階段，隨著發酵的進行，對香豆酸和松柏醇的含量逐漸降低，說明對香豆酸和松柏醇可能主要在前4個階段參與反應。Podstolski研究表明，對香豆酸在非氧化性鏈縮短酶4HBS的作用下可以轉化為4-羥基苯甲醛[5]。 陳化階段有所回升，可能來源于別的物質的轉化，如酪氨酸在苯丙氨酸解氨酶和酪氨酸氨裂解酶共同作用下可以形成對香豆酸[26]。阿魏酸也可以直接還原成松柏醇或去甲基化成咖啡酸[16]。木質素在木質素過氧化物酶和漆酶的作用下解聚為愈創木酚中間體，再進一步也轉化為許多酚類化合物，如松柏醇、松柏醛、阿魏酸、香蘭素、香草酸和對羥基肉桂醛等[19]。

2.1.2 主要風味成分的動態變化

(1)香草酸和香蘭素

發酵過程中香草酸和香蘭素的含量的變化如圖2-B1和2-B2所示。由圖可知隨著發酵的進行，香草酸和香蘭素的含量逐漸增加，在陳化豆莢中含量最高。這一點也和實際情況具有一致性，隨著發酵的進行，香氣逐漸變得濃郁，說明主要的風味物質的種類和含量都得到進一步的增強，并且和其他階段相比，陳化為發酵的最后一步，歷時半年以上，這期間豆莢會發生多種化學反應和生化反應，如酯化、醚化、氧化等反應，形成香草蘭特有香氣[27]。從圖中也可以看出，香草酸主要在陳化階段產生，然而香蘭素主要產生于發汗階段。香蘭素在發汗之后增加緩慢，可能是因為一部分香蘭素參與了不同的化學或酶促反應，而這些反應也可能會形成香氣化合物，這對于確定香草蘭的最終質量至關重要[28-30]，而且Havkin-Frenkel等研究也表明，干燥和陳化會導致香蘭素和其他風味物質的損失[31]。另外與香氣形成沒有直接關系的其他反應也可以解釋香蘭素的這些損失，例如升華，與水共蒸發[30]，或與豆莢中的木質素形成共價鍵[29]。因此，香蘭素的實際產量高于我們所檢測到的含量。

(2)對羥基苯甲酸和對羥基苯甲醛

發酵過程中對羥基苯甲酸和對羥基苯甲醛的含量的變化如圖2B3和B4所示，由圖可知隨著發酵的進行，對羥基苯甲酸和對羥基苯甲醛都是在發汗階段含量最低，在干燥和陳化階段逐漸升高。這一點和浦帆等的研究結果具有一致性[32]。研究表明陳化豆莢中對羥基苯甲酸和對羥基苯甲醛濃度分別為100 mg/kg干重和1 g/kg干重[11]。在現代分析技術的支持下，在鮮豆莢中發現了對羥基苯甲酸和對羥基苯甲醛的糖苷[22，33]。因此，對羥基苯甲酸和對羥基苯甲醛可能來自于其葡萄糖苷的水解，并且這種水解反應可能主要在干燥階段和陳化階段發生。

圖2 不同發酵階段香草蘭豆莢主要風味成分的動態變化

2.2 蛋白的動態變化

如圖3所示，SDS-PAGE分析結果表明：不同發酵階段的香草蘭蛋白有很大的差異，并且隨著發酵的進行蛋白逐漸減少。其中鮮豆莢的蛋白分布范圍比較寬，蛋白主要集中在26～90 kD。和鮮豆莢相比，殺青豆莢的蛋白有所減少，其中小于19 kD的蛋白消失。和鮮豆莢相比，發汗豆莢，干燥豆莢，陳化豆莢的蛋白變化非常明顯，蛋白數量明顯減少，分子量集中表現在19～35 kD和蛋白條帶上部，說明隨著發酵的進行，蛋白可能發生了部分降解和一些交聯。Hansen等[34]研究表明，在酪蛋白酸鈉或乳清蛋白濃縮物存在下香蘭素的風味強度會降低，作者猜測這種降低可能是由于半胱氨酸-醛縮合或希夫堿形成。Pkw等[35]研究表明增加香蘭素和蠶豆蛋白質膠束(PMM)的濃度可以增加蛋白質與香蘭素結合的百分比，熱處理(變性)PMM的結合能力高于未處理(天然)PMM的結合能力。而隨著發酵的進行香蘭素的含量是逐漸升高的，因此蛋白可能發生了降解或則交聯。在發汗和干燥階段在35 kD左右和19 kD左右的蛋白條帶顏色逐漸加深，說明此區間內亞基種類增多，所占比例增大。但是在陳化階段，和發汗和干燥階段相比，35 KD左右和19 KD左右的蛋白條帶顏色變淺，可能是由于陳化生香期間蛋白發生了降解。從3-DE圖譜中可以看出隨著發酵的進行，蛋白的數量變少了，這和SDS-PAGE電泳圖的結果具有一致性。

3 討論與結論

圖3 不同發酵階段香草蘭豆莢蛋白的SDS-PAGE電泳圖和雙向電泳圖

通過LC-MS/MS方法探究了不同發酵階段的香草蘭豆莢主要風味前體物L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、阿魏酸、葡萄糖、咖啡酸、肉桂酸、對香豆酸、松柏醇的消長規律和主要風味物質香草酸、香蘭素、對羥基苯甲酸、對羥基苯甲醛的消長規律。對于主要風味前體物而言，L-苯丙氨酸的含量在發汗階段最高。而L-酪氨酸的含量在發汗、干燥、陳化階段逐漸降低。阿魏酸和葡萄糖的含量從鮮豆莢到殺青豆莢呈現上升趨勢，發汗階段下降，干燥和陳化階段又逐漸升高。咖啡酸和肉桂酸的含量在鮮豆莢到發汗階段呈現上升趨勢，在干燥階段開始下降，陳化階段開始回升。對香豆酸和松柏醇從鮮豆莢到干燥階段的含量呈現下降趨勢，陳化階段開始回升；對于主要風味物質而言，香草酸和香蘭素的含量從殺青階段到陳化階段逐漸增加。在發汗階段對羥基苯甲酸和對羥基苯甲醛的含量最低，在干燥和陳化階段逐漸升高。此外還探究了不同發酵階段的香草蘭豆莢蛋白的動態變化，電泳圖表明隨著發酵的進行蛋白條帶逐漸減少，并且鮮豆莢和殺青豆莢的蛋白分布范圍比較寬，陳化豆莢的蛋白分布范圍比較集中。本文主要探究了主要風味成分及其前體物的消長規律，而對于在發酵過程中風味前體物與風味前體物之間，風味成分與風味成分之間，前體物與風味成分之間的相互轉化，可能是通過內源酶或與豆莢互作的微生物進行作用的。