木犀草素納米制劑通過介導ERK/p38 MAPK/ JNK改善體內外氧化應激損傷作用機制研究

梁 晨，王葉葉，江 羽，譚立偉,2，譚 睿,2*

1西南交通大學醫學院； 2西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031

氧化應激是指機體內活性氧(ROS)聚集過多，體內清除氧自由基與氧化物質失衡，造成了組織細胞氧化損傷[1]。大量研究表明，氧化應激是造成腦缺血再灌注損傷的主要因素。腦缺血再灌注期間，ROS過度生成，而ROS能夠直接與缺血腦組織細胞中的大分子物質如核酸、脂質及蛋白發生過氧化，造成腦組織不可逆的損傷[2]。同時，過量氧自由基的產生會進一步損傷內皮細胞，引起腦組織的微循環障礙和血腦屏障(BBB)通透性增加，導致外源性物質進入腦組織，加重腦損傷[3]。再灌注期間產生的NO會抑制線粒體呼吸鏈，介導其他相關毒性自由基的產生，誘導細胞凋亡[4]。因此，消除過多的ROS與抑制細胞凋亡可對治療缺血性腦損傷提供有益的干預[5]。

木犀草素是一種天然黃酮類化合物，近年來研究發現木犀草素具有抗氧化、改善缺血引起的腦損傷及抗細胞凋亡等作用[6]。其結構中的羰基可以作為氫供體來還原自由基，具有良好的抗氧化作用[7]。然而，其水溶性差、代謝快等缺點極大地限制了木犀草素的臨床應用[8]。因此改善此類活性藥物缺陷的傳輸體系亟待研發。研究表明，木犀草素可通過納米技術制備成聚合物膠束來實現提高其溶解性和穩定性，增強藥效的目的[9]。其中,由聚氧乙烯 (PEO)-聚氧丙烯 (PPO)-聚氧乙烯 (PEO) 組成的三嵌段共聚物泊洛沙姆以其低毒、低免疫原性和生物相容性等好的優點,在膠束載藥領域的研究中倍受青睞[10]。因此，本文采用泊洛沙姆(F127)包裹木犀草素制備納米膠束，對木犀草素納米制劑在體內外抗氧化應激損傷作用及機制進行研究。

1 材料與試劑

1.1 材料

木犀草素對照品(純度≥99.7%，成都普思生物科技公司，批號：180314)；香葉木素標準品(純度≥99.7%，成都普思生物科技公司，批號：180321)；泊洛沙姆(F127)(Sigma，批號：P2443)；大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC12細胞，中國科學院上海細胞所)；SPF級雄性SD大鼠(280～300 g，成都達碩實驗動物有限公司)。

1.2 試劑

藥用級乙醇(阿拉丁試劑公司，批號：C1816012)；高糖DMEM培養基(Hyclone，批號：J180003)；四甲基偶氮唑鹽(MTT粉末，銳賽生物公司，批號：180315)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(源葉生物科技有限公司，批號：BCBR5460V)；4%多聚甲醛(Biosharp，批號：180119)；H2O2溶液(無錫市蘇強化工有限公司，批號：20180322)；β-Actin Mouse Monoclonal Antibody(碧云天生物技術公司，批號：AF0003)；FITC標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(碧云天生物技術公司，批號：A0562)；DAPI(谷歌生物有限公司，批號：20180326)；鼠抗人p-JNK、p-ERK、p-p38單克隆抗體(Servicebio，批號：GB12001)；HRP標記山羊抗鼠的二抗(Servicebio，批號：GB23301)；SOD、MDA、GSH-Px檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20180206)，其余試劑均為分析純。

2 實驗方法

2.1 木犀草素納米制劑的制備與表征

將5 mg木犀草素對照品和100 mg的F127共同分散在5 mL H2O中，超聲10 min至溶液澄清，過0.22 μm濾膜除去熱源及未被包裹的藥物，凍干備用[11]。將制備好的膠束通過馬爾文粒度儀測定其粒徑大小和分布，同時采用透射電鏡觀察其形貌。通過HPLC對其載藥量和包封率進行測定。色譜條件：色譜柱：phenomenex-C18；流動相：甲醇-0.2%磷酸(55∶45)；流速：1.0 mL/min。

包封率=(膠束內木犀草素的含量/投藥量)×100%

載藥量=(膠束內木犀草素的含量/膠束的總質量)×100%

通過透析方法研究木犀草素納米膠束的體外釋放行為。準確移取2 mL木犀草素納米膠束溶液(N-Lu)至透析袋(截留分子量：8 000 Da)中，密封后置于20 mL 的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)，37 ℃空氣浴中進行體外釋放實驗。在釋放1、2、4、8、12、24、48、72、96、120 h后，分別取出等分試樣2 mL透析液，并用相同量的磷酸鹽緩沖溶液代替。通過HPLC測量在指定時間點釋放的木犀草素的量。同時采用相同濃度的木犀草素/二甲亞砜(DMSO)溶液作為游離木犀草素組(F-Lu)進行考察。

2.2 木犀草素納米制劑對PC12細胞氧化應激損傷的影響

將PC12細胞接種于含有10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養基中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，取對數生長期的PC12細胞按照2×104個/孔接種于96孔板中，設置對照組(Control)、模型組(H2O2)、游離木犀草素組(F-Lu)、木犀草素納米制劑組(N-Lu)。給藥組24 h后加入2、5、10、20、40、50、100 μmol/L濃度的F-Lu及N-Lu。繼續孵育24 h后各組加入400 μmol/L H2O2溶液誘導4 h，對照組不做處理。每孔加入20 μL終濃度為5 mg/mL的MTT溶液，培養2～4 h，棄去上清，加入150 μL DMSO振蕩10 min，待孔內紫色顆粒完全溶解后于570 nm波長處用酶標儀測取OD值，計算細胞存活率[12]。同時，將PC12細胞接種于6孔板中，按上述給藥方式進行處理，之后進行β-actin免疫熒光染色，觀察細胞的形態學變化[13]。

利用western-blot檢測JNK、ERK和p38 MAPK蛋白磷酸化水平。取上述各組細胞，BCA法蛋白定量。經SDS-PAGE電泳分離后，轉移至PVDF膜上，PBST漂洗，4 ℃過夜孵育，加入一抗和二抗，ECL化學發光，顯影。

2.3 木犀草素納米制劑對大鼠腦缺血再灌注損傷氧化應激水平的影響

根據文獻[14]所述方法建立大鼠右側大腦缺血再灌注損傷模型。將健康雄性SD大鼠隨機分為4組：假手術組(Sham)、模型組(IR)、游離木犀草素組(F-Lu)、木犀草素納米制劑組(N-Lu)，每組20只，F-Lu、N-Lu組分別尾靜脈給予木犀草素對照品、木犀草素納米制劑(10 mg/kg)，Sham組和IR組均給予生理鹽水。之后根據Zea Longa五分制法對大鼠神經功能損傷狀態進行評分[15]。24 h后，對大鼠進行股動脈取血，5 000 rpm離心5 min取上清，-20 ℃保存備用。血清樣品按照試劑盒操作說明處理，測定SOD、MDA、GSH-Px值。完整取出大鼠腦組織，進行TTC染色并計算各組腦梗死體積。各組腦部含水量通過以下公式計算：

腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%

2.4 木犀草素納米制劑的藥代動力學研究

2.4.1 工作液配制

木犀草素對照品溶液：精密稱取木犀草素對照品29.11 mg于25 mL量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1.16 mg/mL的對照品溶液，4 ℃保存備用。

內標溶液：精密稱取香葉木素對照品20.07 mg于25 mL的量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.807 mg/mL的內標溶液，4 ℃保存備用。

2.4.2 給藥方案及血樣采集

將健康雄性SD大鼠隨機分為2組，分別尾靜脈給予木犀草素對照品和木犀草素納米制劑，并于給藥后5、15、30 min、1、2、4、6、8、10 h采血，5 000 rpm離心5 min取上清，-20 ℃保存備用[16]。

2.4.3 血漿樣品的處理與測定

取100 μL大鼠血漿樣品，加入10 μL香葉木素溶液、10 μL甲醇、100 μL HCL溶液(10 mol/L)混勻，在80 ℃水浴2 h，冷卻后加入50 μL 10%的三氯乙酸溶液，渦旋混勻3 min，加入2 mL乙酸乙酯萃取，渦旋混勻3 min，10 000 rpm離心10 min，吸取上層乙酸乙酯層，N2吹干，100 μL甲醇復溶，12 000 rpm離心10 min，取上清液，4 ℃保存備用。

2.5 數據分析

3 實驗結果

3.1 木犀草素納米制劑表征

木犀草素納米制劑形態見圖1A，載藥膠束呈規則球形或橢圓形，分布均勻，彼此不粘連。如圖1B所示，粒徑在30 nm左右。木犀草素納米制劑的載藥量和包封率實驗結果如表1所示。投藥量在2%～5%范圍內，包封率均保持在95%以上，之后隨著投藥量不斷增加，包封率明顯降低。

本實驗采用投藥量為5%的木犀草素納米膠束進行體外釋放研究。如圖2所示，從藥物釋放曲線中發現，F-Lu在24 h內幾近完全從透析袋中釋放出來。而N-Lu的藥物累計釋放量在相同時間內僅58.7%，這表明膠束可防止木犀草素在最初發生突釋，使其在體內的循環時間和生物利用度增加。

圖1 木犀草素納米制劑表征Fig.1 Characterization of luteolin nano-formulation注：A.電鏡圖；B.粒徑分布。Note：A.TEM image； B.Particle size distribution.

表1 木犀草素納米制劑載藥量和包封率

圖2 木犀草素納米制劑體外釋放曲線Fig.2 In vitro release curve of luteolin nano-formulation

3.2 木犀草素納米制劑對PC12細胞氧化應激損傷的影響

細胞活性檢測結果如圖3所示。與Control組相比，H2O2顯著性降低了PC12細胞的存活率(P<0.01)，當加入木犀草素預保護后，在5～10 μmol/L濃度范圍內隨著木犀草素濃度增高，細胞存活率明顯提高(>85%)。此外，與F-Lu組相比，N-Lu組的細胞存活率顯著提高(P<0.05)。隨著木犀草素劑量的增加，PC12細胞的存活率呈現下降趨勢，說明木犀草素對抗氧化應激作用具有劑量依存關系，10 μmol/L濃度左右，其抗氧化應激作用最強。以上結果表明，木犀草素納米制劑能夠進一步減輕PC12細胞的氧化應激損傷。

圖3 木犀草素納米制劑對H2O2誘導PC12細胞存活率的影響(n=6)Fig.3 Effect of luteolin nano-formulation on PC12 viabilities induced by H2O2(n=6)注：△△P <0.01：與空白對照組相比；##P <0.01、#P <0.05：與H2O2組相比；* P <0.05：與游離木犀草素組相比。Note:△△P <0.01 vs Control；## P <0.01、#P <0.05 vs H2O2；*P <0.05 vs F-Lu.

此外，對各組PC12細胞的細胞骨架進行免疫熒光染色，觀察其形態學變化。如圖4所示，正常PC12細胞的骨架紋理清晰，呈典型的密集網絡狀結構，狀態良好[17]。而Model組相比Control組，細胞邊緣發生皺縮，骨架纖維間隙變大，有骨架斷裂出現。實驗組給藥后細胞狀態均有所恢復。相比F-Lu組，N-Lu的細胞骨架清晰，著色均勻，細胞形態更為理想。結果表明，木犀草素納米制劑不僅能夠提高氧化應激環境中細胞的生存率，同時能夠減輕由于氧化應激介導的細胞形態學改變。

MAPK作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的一員，可以響應包括氧化應激在內的各種刺激，調控著許多生理活動，如炎癥、凋亡等，其三個主要成員為ERK1 /2、JNK、p38 MAPK[18]。因此采用western-blot檢測各組PC12細胞中三個信號轉導蛋白的磷酸化水平。結果如圖5所示，與F-Lu組相比，N-Lu組p-JNK、p-p38、p-ERK1/2表達水平顯著降低(P<0.01)。表明木犀草素納米制劑可通過抑制JNK、p38、ERK1/2磷酸化活性來減少細胞凋亡，顯著提高抗氧化應激損傷水平。

圖4 木犀草素納米制劑對PC12細胞形態學的影響Fig.4 Effect of luteolin nano-formulation on the morphology change of PC12 cells

圖5 木犀草素納米制劑對PC12細胞中p-JNK,p-P38,p-ERK1/2磷酸化水平的影響Fig.5 Effect of luteolin nano-formulation on phosphorylation of p-JNK,p-P38 and p-ERK1/2 in PC12 cells注：△△P <0.01：與空白對照組相比；##P <0.01、# P <0.05：與H2O2組相比；**P <0.01：與游離木犀草素組相比。Note:△△P <0.01 vs Control；## P <0.01、# P <0.05 vs H2O2；**P <0.01 vs F-Lu.

3.3 木犀草素納米制劑對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

大鼠腦梗染色結果如圖6所示。同時腦梗死體積及腦含水量的測定結果見表2。與Sham組相比，IR組的腦梗死體積和含水量均顯著性增加(P<0.05)，與IR組相比，給藥之后腦梗死體積顯著降低(P<0.01)，相比F-Lu組，N-Lu組腦梗死體積顯著性減少，具有差異性(P<0.05)。表明木犀草素納米制劑能夠有效減少缺血再灌注損傷導致的梗死體積。然而，由于缺血再灌注損傷可引起BBB通透性顯著增加，造成神經細胞間質出現明顯水腫，因此含水量的高低可間接表明BBB受損程度[19]。如表2所示，各手術組腦含水量均有所增加，治療組的含水量相比IR組有一定的降低，但無顯著性差異，這可能是由于在短時間內，BBB的通透性并未完全恢復導致的外源性物質向腦組織內流。

圖6 大鼠腦部TTC染色Fig.6 TTC staining of rats brain

表2 木犀草素納米制劑對大鼠腦梗死體積及腦含水量的影響

注：△△P<0.01、△P<0.05：與假手術組相比；##P<0.01：與模型組相比；*P<0.05：與游離木犀草素組相比。

Note:△△P<0.01、△P<0.05 vs Sham；##P<0.01 vs IR；*P<0.05 vs F-Lu.

3.4 木犀草素納米制劑體內抗氧化損傷作用機制研究

抗腦缺血再灌注損傷體內實驗表明，木犀草素納米制劑能夠顯著性降低IR損傷，其體內作用機制研究結果如表3所示。SOD及GSH-Px是機體內重要的抗氧化物質，能夠直接清除自由基，保護機體免受氧化應激損傷。因此，SOD及GSH-Px含量的高低直接反映了體內抗氧化作用的強弱。同時，MDA的含量可用于直接反應組織受氧化損傷的程度。結果顯示，與Sham組相比，IR組血樣中SOD、GSH-Px含量顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)。與IR組相比，給藥組氧化應激損傷水平顯著改善。相比F-Lu組，N-Lu組SOD、GSH-Px水平升高，MDA含量明顯降低，具有顯著性差異(P<0.01)。

3.5 木犀草素納米制劑的藥代動力學研究

經尾靜脈注射，分別給予SD大鼠F-Lu和N-Lu(10 mg/kg,木犀草素量計)，在設定時間點進行樣品采集和測定，計算各時間點血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線如圖7所示。同時，經DAS軟件自動擬合數據，計算相關藥代動力學參數見表4。結果顯示，對比F-Lu組，N-Lu組的峰濃度提高，半衰期延長，藥時曲線下面積明顯增大。

表3 木犀草素納米制劑對大鼠血樣中SOD、MDA、GSH-Px的影響

注：△△P<0.01：與假手術組相比；##P<0.01 、#P<0.05：與模型組相比；**P<0.01：與游離木犀草素組相比。

Note:△△P<0.01 vs Sham；##P<0.01 、#P<0.05 vs IR；**P<0.01 vs F-Lu.

圖7 大鼠體內平均血藥濃度-時間曲線Fig.7 Mean plasma concentration-time curve in rats

參數 ParameterF-LuN-Lut1/2(hr)3.13.9Cmax(μg·mL-1)2.6±0.133.1±0.11AUC0→last(hr·μg·mL-1)5.9±0.199.5±0.10??MRT(hr)2.9±0.113.4±0.09CL_obs(hr·mL·kg)2 809.4±0.071 609.4±0.05Vss_obs(mL·kg-1)13 725.2±0.0310 065.0±0.03

注：**P<0.01：與游離木犀草素組相比。

Note:**P<0.01 vs F-Lu.

4 討論

目前臨床使用的木犀草素口服劑型存在生物利用度低、血藥濃度達峰時間長等不足，極大地限制了其推廣應用；不僅如此，由于木犀草素在水中的低溶解性，給開發其靜脈劑型也帶來了很大的困難[20]。本文中，使用了泊洛沙姆包裹木犀草素，制備成納米膠束制劑，有效地改善了疏水藥物木犀草素在水溶液中的分散性，突破了其在靜注給藥中的使用限制。不僅如此，在制備過程中不含有機溶劑，避免了傳統輸水藥物靜脈制劑(如泰素帝等)中有機溶劑殘留所引起的毒副反應。此外，本研究中所制備的木犀草素納米制劑具有粒徑分布均一、載藥性能較高等特點，可改善木犀草素自身的成藥性缺陷，提高了木犀草素的臨床使用價值及應用前景。

肌動蛋白是構成細胞骨架的主要成分，其與細胞形態變化密切相關，而細胞形態學的變化可直接反應出細胞的狀態。有研究顯示，細胞凋亡過程中肌動蛋白細絲發生斷裂，骨架結構遭到破壞[21]。體外H2O2誘導PC12細胞氧化應激損傷結果表明木犀草素納米制劑不僅顯著性提高了PC12細胞的存活率，而且能夠進一步保持細胞結構的完整性，通過抑制JNK、p38、ERK磷酸化水平從而減少由于氧化應激損傷所造成的細胞凋亡。

綜上所述，木犀草素納米制劑改善了木犀草素單體的成藥性缺陷，增強了體內外抗氧化應激作用，同時有效地改善了腦缺血再灌注損傷，為缺血性腦損傷的治療研究提供了新的思路，具有潛在的臨床應用前景。