熊果酸改善自然衰老大鼠糖脂代謝紊亂與自噬能力的研究

賴 穎，馬 朋，姚 玲，李海飛2,，袁春琳，李春莉，王建偉*

1重慶醫(yī)科大學生命科學研究院；2重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院；3重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶 400016

伴隨生物分子、組織細胞及器官的慢性持續(xù)性損傷和功能減退，衰老機體易受疾病侵害而加速死亡[1,2]。早有文獻報道在機體衰老過程中胰島素抵抗和脂質(zhì)異位沉積等代謝綜合癥的發(fā)生率明顯上升，而胰島素抵抗又被認為是促使肝臟形成脂肪肝的關鍵因素之一，可促進脂質(zhì)代謝紊亂，促使過多的游離脂肪酸向肝細胞聚集，進一步加重肝細胞脂肪變，過多游離脂肪酸亦可損傷線粒體,并造成氧化應激，產(chǎn)生大量氧自由基，且脂質(zhì)沉積和胰島素抵抗都與自噬有著密切關系[3]。增強自噬可減輕肝臟胰島素抵抗，降解肝臟內(nèi)脂滴,減輕炎癥反應,改善肝臟糖脂代謝紊亂[4,5]。自噬已成為當前衰老相關研究的潛在突破點，尋找能夠通過增強自噬改善衰老相關代謝紊亂的抗衰老藥物已成為現(xiàn)代研究的熱點。

熊果酸(ursolic acid)是一種廣泛存在于天然植物中的五環(huán)三萜類化合物，現(xiàn)已證實熊果酸具有抗炎、抗氧化、降糖、改善胰島素抵抗、調(diào)脂、抗肥胖、抗動脈粥樣硬化等藥理作用，且?guī)缀鯚o其他毒副反應，有望成為抗代謝綜合征新藥[6,7]。同時近年有文獻報道熊果酸能夠增強自噬改善肌萎縮，提高代謝敏感蛋白水平進而延緩細胞衰老[8]，亦有文獻報道其可以減少脂質(zhì)沉積從而改善脂肪肝[9]。本研究主要從自噬角度出發(fā),觀察熊果酸對自然衰老大鼠胰島素敏感性和肝臟甘油三酯沉積的改善作用及其對自噬相關蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 動物實驗

SD大鼠，雄性，SPF級，青年大鼠3月齡體質(zhì)量210～230 g，老年大鼠22月齡440～550 g，重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(渝)2015007，常規(guī)飼養(yǎng)，實驗室溫度21.1 ℃，相對濕度55.5%，12 h明暗交替，自由飲水，經(jīng)適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 藥品及試劑

熊果酸由京都大學Pharmafood研究所饋贈；阿拉伯膠購自上海生物工程有限公司，批號:MC0124B1013J；甘油三酯(TG)和葡萄糖試劑盒購自南京建成生物工程研究所；胰島素測定試劑盒購自日本森永生科學研究所；油紅“O”染色試劑購自德國Sigma公司；LC3A/3B抗體、P62抗體、Beclin1抗體、Drp1抗體、PGC-1α抗體、Pink1抗體購自Cell Signaling Technology；羊抗兔IgG購自博士德生物工程有限公司。

1.3 儀器

勻漿機，德國IAK；酶標儀，日本SANYO公司；電泳儀，美國Bio-Rad公司；光學顯微鏡，日本Olympus公司。

1.4 分組、模型復制及給藥

取22月齡SD雄性大鼠25只，適應性喂養(yǎng)7天后，按平均體質(zhì)量、禁食狀態(tài)下血漿葡萄糖、甘油三酯隨機分為3組，即老年模型組(9只)，熊果酸高、低劑量組(50，10 mg/kg)(各8只)，另取8只3月齡SD雄性大鼠作為青年對照組，每組均給予正常飲食飲水，每兩天記錄攝食量，每三天記錄大鼠體重。青年對照組和老年模型組分別給予5%阿拉伯膠灌胃，熊果酸組分別將藥物溶于5%阿拉伯膠中，按照5 mL/kg灌胃，每日給藥1次，連續(xù)7周，于實驗第7周末稱重并處死大鼠，取肝臟稱質(zhì)量，-80 ℃凍存，用于各項指標分析檢測。

1.5 生化學指標檢測

實驗第6周末，所有大鼠禁食過夜，麻醉后于眼眶后靜脈叢取血，采用肝素鈉抗凝，4 ℃，3 000 rpm，離心15 min，取血漿放入-20 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆茫褂迷噭┖袦y定血漿葡萄糖、甘油三酯、胰島素并計算HOMA-IR指數(shù)，具體操作嚴格按照說明書進行。

1.6 肝臟TG檢測

稱取適量(50～60 mg)肝臟組織，按照組織：異丙醇=100 mg：2 mL比例加入異丙醇，勻漿，4 ℃過夜，離心(3 000 rpm，4 ℃，15 min)，取上清，測定TG含量，具體操作嚴格按照說明書進行。

1.7 油紅“O”染色

取適量4%多聚甲醛固定的肝臟組織，流水沖去多聚甲醛溶液，OCT包埋，冰凍切片8 μm厚度，室溫晾干后用于油紅“O”染色。在光學顯微鏡(BX-51，日本Olympus公司)下觀察脂滴沉積情況，并拍照(×400倍)。

1.8 Western blot檢測蛋白表達

全蛋白提取試劑盒提取肝臟總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。制備10%分離膠，5%濃縮膠，SDS-PAGE電泳，上樣量為50 μg/10 μL，250 mA恒流電轉，用5%脫脂牛奶封閉1h，分別加入LC3A/3B，Beclin1，P62，PGC-1α，Drp1，Pink1抗體，4 ℃搖床孵育過夜，TBST 5×10 min洗膜后加二抗(室溫孵育2 h)，ECL發(fā)光，Image J分析測定各條帶的灰度值，內(nèi)參采用GAPDH。

1.9 統(tǒng)計學處理方法

2 結果

2.1 各組大鼠一般參數(shù)

圖1A和1B結果顯示，與青年對照組比較，老年模型組大鼠攝食量與體質(zhì)量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與老年模型組比較，熊果酸低、高劑量組攝食量和體質(zhì)量無明顯差異(P>0.05)，體重亦無明顯變化。如圖1C和1D所示，與青年對照組比較，老年模型組肝質(zhì)量和肝重比明顯增加，高劑量熊果酸使老年大鼠肝質(zhì)量降低，肝重比也有下降的趨勢。

圖1 熊果酸對各組大鼠一般參數(shù)的影響Fig.1 General parameters of rats in each 注：食物攝入量(A)，體質(zhì)量(B)，肝質(zhì)量(C)和肝重比(D)。#P<0.05代表與青年對照組比較具有統(tǒng)計學差異，*P<0.05代表與老年模型組比較具有統(tǒng)計學差異。Note:Chow intake (A),body weight (B),liver weight (C) and liver weight/body weight ratio (D) in rats. #P<0.05 compared with young normal group,*P<0.05 compared with aging group.

2.2 各組大鼠一般血生化指標

圖2所示，與青年對照組比較，老年模型組血漿葡萄糖、TG含量、胰島素和HOMA-IR指數(shù)明顯升高且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與老年模型組比較，熊果酸高劑量組血漿胰島素，TG，HOMA-IR指數(shù)顯著降低(P<0.05)，血漿葡萄糖無明顯變化。

圖2 熊果酸改善老年大鼠血漿胰島素敏感性Fig.2 Ursolic acid improves insulin sensitivity in aging 注：血漿葡萄糖(A)，甘油三酯(B)，胰島素濃度(C)和HOMA-IR(D)。#P<0.05代表與青年對照組比較具有統(tǒng)計學差異，*P<0.05代表與老年模型組比較具有統(tǒng)計學差異。Note:Plasma Glucose (A),plasma triglyceride (B),insulin (C) concentrations,HOMA-IR index (D).#P<0.05 compared with young normal group,*P<0.05 compared with aging group.

2.3 各組大鼠肝臟脂質(zhì)沉積情況

如圖3所示，與青年對照組相比，老年大鼠肝臟TG含量(圖3A)和油紅O染色面積(圖3B)顯著增加(P<0.05)，提示隨著大鼠年齡的增加其肝臟存在過量的脂質(zhì)沉積；與老年模型組比較，熊果酸高劑量組明顯改善肝臟TG的過量沉積(圖3A-3B)，而熊果酸低劑量組沒有顯著變化。這些結果表明，熊果酸高劑量組比熊果酸低劑量組具有更顯著改善肝臟甘油三酯沉積的作用。

圖3 熊果酸改善老年大鼠肝臟脂質(zhì)沉積Fig.3 Ursolic acid alleviates lipid accumulation in liver of aging 注：肝臟甘油三酯含量(A)，油紅O染色(比例尺：50μm)(B)。#P<0.05代表與青年對照組比較具有統(tǒng)計學差異，*P<0.05代表與老年模型組比較具有統(tǒng)計學差異。Note:Liver triglyceride content (A),Oil Red O staining area (B).#P<0.05 compared with young normal group,*P<0.05 compared with aging group.

2.4 肝臟自噬相關蛋白的變化

由于熊果酸低劑量組各項指標作用效果均不明顯，故在肝臟自噬相關蛋白檢測中選取了青年對照組、老年模型組和熊果酸高劑量組。通過western blot分析得出結果如圖4，與青年對照組比較，模型組顯著降低了LC3B/3A比值及Beclin1蛋白的表達(P<0.05)，熊果酸高劑量組上調(diào)了這兩種蛋白(P<0.05)，提示老年大鼠肝臟自噬能力明顯降低，而熊果酸高劑量組有效地逆轉了這一現(xiàn)象。P62蛋白在三組間均沒有明顯變化。

圖4 熊果酸對老年大鼠肝臟自噬的增強作用Fig.4 Ursolic acid enhances autophagy in liver of aging 注：自噬相關蛋白：LC3A/3B(A),Beclin1(B)，P62(C)。#P<0.05代表與青年對照組比較具有統(tǒng)計學差異，*P<0.05代表與老年模型組比較具有統(tǒng)計學差異。Note:Autophagy-related protein:microtubule-associated protein 1 light chain 3 LC3A/3B (A),Beclin1(B),P62(C).#P<0.05 compared with young normal group,*P<0.05 compared with aging group.

2.5 肝臟線粒體受損相關蛋白的變化

與青年對照組相比，老年模型組PGC-1α，Drp1蛋白的表達明顯下降，給予熊果酸50 mg/kg治療7周后，其表達顯著升高且具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。這一結果提示老年大鼠肝臟線粒體受損，熊果酸可以改善線粒體受損，提高線粒體質(zhì)量。

圖5 熊果酸改善老年大鼠肝臟線粒體功能Fig.5 Ursolic acid ameliorates mitochondria dysfunction in liver of aging 注：線粒體質(zhì)量控制相關蛋白：PGC-1α(A)，Drp1(B)，Pink1 (C)。#P<0.05代表與青年對照組比較具有統(tǒng)計學差異，*P<0.05代表與老年模型組比較具有統(tǒng)計學差異。Note:Mitochondrial quality control-r elated proteins:PGC-1α (A),Drp1 (B),Pink1 (C).#P<0.05 compared with young normal group,*P<0.05 compared with aging group.

3 討論

有研究通過高脂飲食建立了NAFLD大鼠模型同時灌胃給予熊果酸進行干預發(fā)現(xiàn)熊果酸能有效降低肝臟TG沉積，改善高脂飲食所致胰島素抵抗，對NAFLD大鼠肝臟具有保護作用[10]，所以我們猜測熊果酸在自然衰老大鼠中可能具有相同作用。實驗結果顯示，無論是熊果酸低劑量還是高劑量對老年大鼠的正常飲食體重均沒有影響(圖1A～B)，排除因熊果酸對其攝食的影響而引起各代謝指標變化。文獻報道[11]熊果酸可以降低肝質(zhì)量與肝重比，但具體機制尚不明確，而我們的實驗結果與此一致，即給予熊果酸(50 mg/kg)后明顯降低了肝質(zhì)量，這一現(xiàn)象有待進一步研究。同時與預期結果一致，熊果酸(50 mg/kg)明顯降低了血漿胰島素和HOMA-IR指數(shù)，改善了老年大鼠胰島素敏感性的下降；從肝臟TG檢測與油紅O染色結果看，在給予熊果酸(50 mg/kg)治療后肝臟TG沉積明顯減少，提示在機體老化中逐步出現(xiàn)了甘油三酯沉積和胰島素抵抗，在給予熊果酸治療后顯著改善了上述不良現(xiàn)象。

通過查閱文獻我們發(fā)現(xiàn)，自噬可降解肝細胞內(nèi)的脂滴改善脂肪肝，從而起到對肝臟的保護作用[12]。自噬發(fā)生過程中，微管相關蛋白輕鏈3(LC3)是誘導自噬發(fā)生的關鍵分子，LC3B是形成自噬體的標志分子，LC3B/LC3A比值與自噬成正相關，可初步判斷自噬的發(fā)生[13]。同時在自噬發(fā)生中Beclin1的表達水平往往會上升，許多自噬調(diào)控蛋白通過與Beclin1的不同結構域或氨基酸發(fā)生直接或間接結合形成蛋白復合體，進而調(diào)控自噬水平[14]。本次研究結果表明，老年大鼠LC3B/LC3A比值顯著降低，提示自然衰老過程中肝臟發(fā)生自噬的能力減弱，而在給予熊果酸(50 mg/kg)治療后，其比值明顯上升，Beclin1的結果與LC3B/LC3A一致，表明熊果酸可以促進肝自噬的發(fā)生。研究顯示一個完整的細胞自噬過程包括自噬誘導、自噬體形成及自噬溶酶體的降解。LC3B與Beclin1均是參與自噬體的形成過程，P62則是作為一種參與多種信號轉導的蛋白，可連接LC3和泛素化的底物，隨后被整合到自噬體中并在自噬溶酶體中被降解，參與自噬體的降解過程，從而形成一個動態(tài)的自噬流[15]。自噬發(fā)生時，P62水平下降；而自噬受抑制時，P62水平上升。在本次實驗中，P62在老年模型組中下降，用藥干預后有上升趨勢，但無統(tǒng)計學差異，故我們考慮熊果酸是否是通過其他途徑進行自噬溶酶體的降解從而改善自噬流完成對受損細胞的清除作用，有待進一步研究。

如前言所述，老化機體易發(fā)生胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂，過多游離脂肪酸可損傷線粒體，并造成氧化應激，產(chǎn)生大量氧自由基，而細胞的自噬機制逐漸減弱，使損傷的線粒體逐漸堆積，最終又加劇衰老，通過線粒體自噬清除受損線粒體能夠抑制細胞的衰老[16]。所以本次實驗我們進一步檢測了線粒體質(zhì)量控制相關蛋白PGC-1α，Drp1，Pink1來判斷線粒體是否有損傷及熊果酸對其是否有改善作用。PGC-1α是線粒體生成的關鍵調(diào)控因子，可增強核受體及相關轉錄蛋白的轉錄活性，刺激線粒體合成和呼吸的發(fā)生[17]。結果顯示，與青年對照組比較，老年組PGC-1α顯著降低，說明線粒體生物發(fā)生明顯減少，而熊果酸治療后逆轉了這一結果，提高了線粒體質(zhì)量。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，和線粒體分裂有關的蛋白質(zhì)也參與到了線粒體自噬過程中，Drp1是一種與線粒體分裂有關的蛋白[18]，其結果與PGC-1α一致，表明老年鼠線粒體動力減弱，自噬也相應減少，而用藥后有了明顯的上升趨勢。Pink1是一種主要存在于線粒體內(nèi)膜的蛋白激酶，通過激活Parkin這一E3泛素蛋白連接酶，從而使受損線粒體的陰離子電位通道蛋白VDAC1泛素化，從而啟動線粒體的降解過程[19]。本實驗結果中Pink1并沒有明顯差異，提示受損線粒體的清除可能不是通過Pink1-Parkin途徑發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究結果表明，在自然衰老大鼠中出現(xiàn)了胰島素敏感性降低，肝臟脂質(zhì)沉積增加，線粒體質(zhì)量損壞，自噬能力減弱，而熊果酸能夠改善老年大鼠這些不良現(xiàn)象，提示熊果酸具有改善衰老相關糖脂代謝紊亂和自噬減退的能力。