響應(yīng)面法優(yōu)化紫甘薯發(fā)酵酒的工藝條件

于聰，李艷，2，*

（1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

紫甘薯屬甘薯類植物，又名紫薯、山川紫[1-2]，我國廣為種植[3]，因土壤差異和栽培條件不同，形態(tài)和成分也不同[4-7]。紫甘薯富含豐富的花青素類功能物質(zhì)和膳食纖維，日益成為大眾追捧的健康飲食，深加工產(chǎn)品開發(fā)日漸深入[8-10]。目前利用紫甘薯開發(fā)的深加工產(chǎn)品有速溶紫甘薯粉、紅薯啤酒、紅薯葡萄酒等[11]。

冀紫薯2號(hào)是河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所選育的紫甘薯新品種，本研究以此為原料，通過單因素和Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化紫甘薯酒的發(fā)酵工藝條件，釀造紫甘薯發(fā)酵酒，為紫甘薯新品種的深加工奠定應(yīng)用基礎(chǔ)，擴(kuò)大工業(yè)開發(fā)價(jià)值和市場(chǎng)潛能。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器設(shè)備

紫甘薯-冀紫薯2號(hào)：河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所；α-淀粉酶（883 U/g）、糖化酶（100 000 U/g）：上海寶曼生物科技有限公司；葡萄糖、沒食子酸：天津市紅巖化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠；石油醚：天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；酒石酸鉀鈉、檸檬酸：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；苯酚：天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司，以上試劑均為分析純。商用活性干酵母（安琪、SC、F15）：北京賽普瑞森技術(shù)有限公司。試驗(yàn)中用到的儀器與設(shè)備見表1。

表1 試驗(yàn)儀器設(shè)備表Table 1 Table of experimental equipments

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫甘薯酒釀造工藝流程

新鮮紫甘薯清洗→剔除霉斑→蒸熟→加熱水打漿→淀粉液化→調(diào)節(jié)pH 值，糖化→調(diào)節(jié)pH 值，接種酵母→發(fā)酵→陳釀→澄清處理→過濾→紫甘薯酒

1.2.2 紫甘薯酒釀造工藝說明

原料預(yù)處理：新鮮紫甘薯清洗后剔除霉斑，取樣檢測(cè)各種基礎(chǔ)理化數(shù)據(jù)，包括：水分、淀粉、總糖、還原糖、滴定酸、粗脂肪、粗蛋白、花色苷和總酚等。

蒸熟、打漿：新鮮紫甘薯切片1 cm 厚，常壓蒸煮40 min，出鍋后添加預(yù)先加熱到90℃以上熱水，料液比 1∶5（g/mL），打漿攪拌均勻。

淀粉液化和糖化：紫甘薯淀粉的液化和糖化采用耐高溫α-淀粉酶和糖化酶。淀粉酶加量2 U/g 原料，于92.5℃液化75 min；糖化酶加量400 U/g 原料，調(diào)pH 4.5，于50℃糖化50 min，制得紫甘薯糖液。

紫甘薯酒發(fā)酵：調(diào)整紫甘薯糖液的糖含量至220 g/L，pH 4.0，接種酵母菌進(jìn)行控溫發(fā)酵制得紫甘薯發(fā)酵原酒。

陳釀、澄清、過濾：主發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)1個(gè)月左右后發(fā)酵，虹吸法倒罐去除酵母泥和沉淀物得到紫甘薯原酒。將原酒置于溫度恒定在14℃～15℃的地下室陳釀半年，虹吸取上清液，加明膠澄清，經(jīng)過濾后得到紫甘薯發(fā)酵酒。

1.2.3 紫甘薯酒發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

酵母菌種選擇：紫甘薯糖液調(diào)pH 4.0，分別接種安琪、SC 和 F15 釀酒酵母，接種量 2×106個(gè)/mL，控制28℃發(fā)酵，以CO2生成量和殘?zhí)呛繛樵u(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇發(fā)酵速度快的菌種。

再以選定的酵母菌進(jìn)行發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)，以CO2生成量、糖含量和酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)。紫甘薯糖液調(diào)pH 4.0，分別固定發(fā)酵溫度24℃，酵母接種量2×106個(gè)/mL，發(fā)酵時(shí)間10 d，分組試驗(yàn)的變量分別為：酵母接種量1×106、2×106、3×106、4×106、5×106（個(gè)/mL）；發(fā)酵溫度：16、20、24、28、32℃；發(fā)酵時(shí)間 6、7、8、9、10、11 d。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)法[12-15]優(yōu)化紫甘薯酒發(fā)酵工藝條件，以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇酵母接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素，因素水平表見表2。

表2 紫甘薯發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Table 2 Table of purple sweet potato fermentation response surface factor level

1.2.5 檢測(cè)方法

水分：稱重法，清洗好的紫甘薯稱重后放入55℃烘箱烘干，恒重后再稱重。

式中：A1為樣品烘干前的總重量，g；A2為樣品烘干后的凈重量，g。

酒精度：比重計(jì)法[16]，取50mL 發(fā)酵后的酒樣和50mL去離子水于蒸餾瓶中，取50 mL 蒸餾液，測(cè)定其酒精度。

CO2生成量：稱重法。對(duì)應(yīng)每個(gè)發(fā)酵罐，取250 mL三角瓶2只，裝液量100 mL，安裝呼吸閥，只有CO2逸出，接種酵母菌為發(fā)酵0 時(shí)，每天稱重1 次～2 次，直到發(fā)酵結(jié)束，計(jì)算CO2生成量。

淀粉：GB/T 5009.9-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中淀粉的測(cè)定》中酸水解法[17]。

總糖：GB/T 15672-2009《食用菌中總糖含量的測(cè)定》中苯酚硫酸法。

還原糖：GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的斐林試劑滴定法。

粗脂肪：索氏抽提法[18]。

粗蛋白：GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中第二法。

滴定酸：GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中 pH 計(jì)法[19-20]。

花色苷：pH 示差法[21-22]，吸取酒樣 1 mL，分別加入12 mL pH 1.0 的緩沖溶液、12 mL pH 4.5 的緩沖溶液，避光放置15 min，在520 nm 和700 nm 波長處測(cè)定吸光度。根據(jù)以下公式計(jì)算花色苷總量。

式中：X 為總花色苷含量，mg/L；A 為（A520-A700）pH1.0-（A520-A700）pH4.5；M 為 449.2 g/mol；ε 為摩爾消光系數(shù)/[L/（mol·cm）]，26 900。

色度和色調(diào)：分光光度計(jì)法[23]：檢測(cè)樣品420 nm（A1）、520 nm（A2）、620 nm（A3）時(shí)的吸光度。

1.2.6 紫甘薯酒感官評(píng)價(jià)

紫甘薯酒的感官測(cè)評(píng)參照GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用的分析方法》。組織具有一定品酒技能和知識(shí)的8個(gè)人進(jìn)行品嘗，從色澤、香氣、口感、組織形態(tài)4個(gè)方面進(jìn)行描述評(píng)價(jià)。感官品評(píng)表見表3。

1.2.7 重復(fù)試驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均為3 次以上重復(fù)。線性方程、重復(fù)性和準(zhǔn)確性試驗(yàn)的數(shù)據(jù)均由Excel 2010 計(jì)算得出；采用Design-Expert 6.0.10 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，Origin 8.5 軟件作圖，Spss 17.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA）和鄧肯法（Duncan's）差異分析。

表3 紫甘薯酒感官評(píng)價(jià)打分表Table 3 Purple sweet potato wine sensory evaluation score sheet

2 結(jié)果與分析

2.1 原料成分分析

冀紫薯2號(hào)紫甘薯是河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所選育的紫甘薯新品種，相關(guān)理化指標(biāo)檢測(cè)數(shù)據(jù)見表4。

表4 冀紫薯2號(hào)理化指標(biāo)檢測(cè)數(shù)據(jù)表Table 4 Table of ji zi no.2 purple sweet potato's physical and chemical indicators test data

由表4數(shù)據(jù)分析，冀紫薯2號(hào)的淀粉含量占原料干物質(zhì)的30.23%，淀粉經(jīng)蒸煮，加水和加酶水解后得到糖，糖是發(fā)酵酒的物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究經(jīng)雙酶法水解后的糖液含可發(fā)酵性糖42.6 g/L，為了釀造酒精度12%vol 以上的發(fā)酵型紫甘薯酒，在接種酵母菌前添加蔗糖，調(diào)整糖含量至220 g/L。紫甘薯花色苷和總酚分別占干物質(zhì)的3.35%和11.03%，經(jīng)發(fā)酵保留到酒中賦予紫甘薯酒抗氧化、降血糖、改善肝功能、防癌等保健功能[24]和鮮艷的色澤外觀。粗脂肪和粗蛋白在水解和發(fā)酵過程中都會(huì)發(fā)生一定程度的水解，在陳釀和澄清時(shí)需予以去除。

2.2 紫甘薯酒發(fā)酵工藝條件單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酵母菌種的確定

各種酵母菌的發(fā)酵條件有一定差異，以CO2生成量和殘?zhí)菣z測(cè)值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇發(fā)酵時(shí)間短、降糖速率快，酒顏色好的酵母菌種進(jìn)行紫甘薯酒的發(fā)酵，結(jié)果見圖1。

圖1 酵母菌種選擇Fig.1 Selected yeast strains

由圖1可見，在相同時(shí)間內(nèi)，安琪酵母的CO2釋放量比SC 和F15 酵母菌的多，降糖速率也快。CO2是酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物，與酒精相伴而生。降糖速率快說明酵母菌的發(fā)酵和原料轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)，在28℃條件下安琪酵母2 d 已經(jīng)將糖降至接近于零，比另外兩株酵母菌達(dá)到相同情況快20 多個(gè)小時(shí)，雖然發(fā)酵時(shí)間太短或許會(huì)使釀造的酒口感粗糙，但可以通過適當(dāng)降低發(fā)酵溫度，延長發(fā)酵時(shí)間促成風(fēng)味物質(zhì)的生成。

2.2.2 酵母接種量對(duì)發(fā)酵的影響

以安琪酵母發(fā)酵紫甘薯酒，5個(gè)不同接種量的發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果如圖2，方差分析見表5。

圖2 酵母接種量對(duì)紫甘薯酒發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum on fermentation of purple sweet potato wine

表5 酵母接種量方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis of yeast inoculation amount

利用spss 軟件，以5組接種量每組3個(gè)平行作為因子，酒精度作為評(píng)判指標(biāo)進(jìn)行了單因素ANOVA，分析結(jié)果如表5，P=0.000〈0.05（顯著性水平在0.05）顯著；多重比較檢驗(yàn)的結(jié)果如圖2A。由圖2可知，酵母菌接種量為2×106個(gè)細(xì)胞/mL 時(shí)，酒精度最高，達(dá)到12.2 % vol，且CO2生成量最多，降糖速率也最快，24℃發(fā)酵10 d 時(shí)，殘?zhí)菐缀鯙榱恪Ｒ话闱闆r下，在發(fā)酵溫度固定時(shí)，隨著接種量加大，發(fā)酵速率也加快。但在液體糖含量一定時(shí)，接種量過大，酵母生長和生存所需物質(zhì)增加，造成酒精生成量降低，所以最優(yōu)酵母接種量取 2×106個(gè)/mL。

2.2.3 溫度對(duì)發(fā)酵的影響

發(fā)酵溫度影響酵母的生長速度和酒精生成，溫度對(duì)紫甘薯酒發(fā)酵的影響見圖3，方差分析見表6。

圖3 溫度對(duì)紫甘薯酒發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of temperature on fermentation of purple sweet potato wine

表6 發(fā)酵溫度方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis of fermentation temperature

利用spss 軟件，以5組發(fā)酵溫度每組3個(gè)平行作為因子，酒精度作為評(píng)判指標(biāo)進(jìn)行了單因素ANOVA，分析結(jié)果如表 6，P=0.000〈0.05（顯著性水平在 0.05）顯著；多重比較檢驗(yàn)的結(jié)果如圖3A。由圖3可知，發(fā)酵溫度低于24℃時(shí)，發(fā)酵液啟酵慢，發(fā)酵時(shí)間長，酒度低；發(fā)酵溫度高于28℃，酵母菌的降糖速率過快，發(fā)酵劇烈，酵母菌衰老也快，最終生成的酒度低。24℃發(fā)酵時(shí)，酒精產(chǎn)生量最大，發(fā)酵和降糖速率適宜，所以最優(yōu)發(fā)酵溫度為24℃。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間的影響

在確定的發(fā)酵溫度和酵母接種量條件下，發(fā)酵時(shí)間對(duì)紫甘薯酒精度的影響如圖4，方差分析見表7。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紫甘薯酒酒度的影響Fig.4 Effect of time on fermentation of purple sweet potato wine

表7 發(fā)酵時(shí)間方差分析結(jié)果Table 7 Results of variance analysis of fermentation time

利用spss 軟件，以6組發(fā)酵時(shí)間每組3個(gè)平行作為因子，酒精度作為評(píng)判指標(biāo)進(jìn)行了單因素ANOVA，分析結(jié)果如表 7，P=0.000〈0.05（顯著性水平在 0.05）顯著；多重比較的結(jié)果如圖4。由圖4可知，在酵母接種量固定2×106個(gè)細(xì)胞/mL，24℃發(fā)酵時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間延長，酒度提高，總糖降低，超過10 d 后，發(fā)酵液中可利用的糖耗盡，安琪酵母開始利用發(fā)酵產(chǎn)物-酒精為碳源來維持自身的生長和繁殖，從而使酒精度降低[25]。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間10 d 進(jìn)行下一步的優(yōu)化。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝條件

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，通過Design-Expert 6.0.10 軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)，以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見表8。

表8 紫甘薯發(fā)酵響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 8 Design and results of response surface for fermentation purple sweet potato

續(xù)表8 紫甘薯發(fā)酵響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 8 Design and results of response surface for fermentation purple sweet potato

2.3.1 響應(yīng)面回歸分析

對(duì)表8 的試驗(yàn)結(jié)果，采用試驗(yàn)因素的相關(guān)性來解釋，試驗(yàn)的誤差越小越好，用方差分析評(píng)價(jià)結(jié)果的顯著性，見表9。

表9 回歸模型的方差分析Table 9 Analysis of variance of regression model

通過軟件分析，得到接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）3個(gè)自變量對(duì)紫甘薯酒酒度的動(dòng)態(tài)參數(shù)方程：

酒精度/（%/vol）=12.36+0.15A+0.16B-0.16C-0.55AB-0.37BC-1.12A2-1.02B2-0.75C2

回歸模型的有效性指F 檢驗(yàn)，包括失擬性檢驗(yàn)和回歸方程顯著性檢驗(yàn)[26]兩部分。回歸模型的系數(shù)反映顯著性。表6 回歸模型方差分析可見：模型顯著性檢驗(yàn)P=0.008 9〈0.05，說明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。自變量二次項(xiàng)A2（P=0.002 5）、B2（P=0.004 0）、C2（P=0.018 2）均低于0.05 說明顯著，二次項(xiàng)AB 不顯著（P=0.064 4〉0.05）；所用模型與實(shí)驗(yàn)擬合的程度用失擬項(xiàng)說明，即二者差異的程度，因?yàn)槭M項(xiàng)P〈0.0001 表示極顯著，沒有失擬因素存在，所以對(duì)模型有利，因此，可用該回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。該方程的決定系數(shù)R2=0.900 0，變異系數(shù)（C.V.）4.54，說明建立的模型能解釋響應(yīng)值變化的90.00%，模型的擬合程度較好，所以模型是合適的。

2.3.2 各因素交互作用的3D 響應(yīng)面圖和等高線圖

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因素A、B、C所構(gòu)成的三維空間立體曲面圖，從響應(yīng)面3D 圖上可直觀形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用[27]。不同因素的響應(yīng)面3D 圖及相應(yīng)等高線圖見圖5。

圖5 兩因素交互作用對(duì)紫甘薯酒酒精度高低的影響Fig.5 The influence of the interaction of two factors on the quality of purple sweet potato wine

由圖5可較直觀地看出各因素交互作用對(duì)紫甘薯酒酒度的影響：由接種量和溫度交互作用的影響，紫甘薯酒酒精度先升高后下降（圖5A）；因?yàn)榻臃N量和時(shí)間交互作用的影響，紫甘薯酒酒精度先升高后下降（圖5B）；又溫度和時(shí)間交互作用的影響，紫甘薯酒酒精度先升高后下降（圖5C）；響應(yīng)值變化的大小[28]反應(yīng)等高線的陡峭性，曲線越陡峭，則表明該因素對(duì)紫甘薯酒酒精度的影響越大。交互作用的強(qiáng)弱表現(xiàn)為等高線的形狀，交互作用顯著為橢圓，交互作用不顯著為圓形[29]。接種量和溫度交互作用的等高線比接種量和時(shí)間、溫度和時(shí)間交互作用的等高線密集且陡峭，所以接種量和溫度對(duì)安琪酵母發(fā)酵影響較大。

2.3.3 最佳試驗(yàn)條件預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

根據(jù)Design-Expert 軟件的分析結(jié)果，得到紫甘薯紅酒理論預(yù)測(cè)最佳工藝條件為：接種量2.05×106個(gè)/mL，溫度24.36℃，發(fā)酵時(shí)間9.74 d，最終達(dá)到的酒精度為12.38%vol 對(duì)最佳發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作條件，將最佳工藝參數(shù)修正為：接種量2×106個(gè)/mL，溫度24℃，發(fā)酵10 d，在該條件下進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)最終測(cè)得紫甘薯酒酒度為12.2%vol，與預(yù)測(cè)值接近，擬合試驗(yàn)誤差1.5%，重復(fù)效果較好。

2.4 紫甘薯酒的感官評(píng)價(jià)

評(píng)價(jià)一款酒的標(biāo)準(zhǔn)包括：顏色、透明度、香氣和風(fēng)味等方面，本研究的紫甘薯發(fā)酵紅酒8 位品評(píng)員給出了84 分的好成績，他們的評(píng)價(jià)是：該酒色澤鮮艷，成紫玫瑰紅色、透明度好、帶有紫甘薯特有的香氣，香味和口感醇厚、酸度適中、酒體協(xié)調(diào)、且余味悠長。

3 結(jié)論

經(jīng)過響應(yīng)面試驗(yàn)得到冀紫薯2號(hào)紫甘薯發(fā)酵紅酒的最佳發(fā)酵條件為：接種量2×106個(gè)/mL，溫度24℃，發(fā)酵10 d，紫甘薯酒的酒精度12.2%vol。色澤鮮艷成紫玫瑰色、透明度好、帶有紫甘薯香味、酸度適中、酒體協(xié)調(diào)、余味悠長。為該品種的開發(fā)應(yīng)用和推廣種植奠定了理論基礎(chǔ)。