miR-194通過調控相關靶向蛋白影響肝癌細胞的增殖和侵襲行為

張 彬 張 瑜

四川省成都市第五人民醫院肝膽外科 611130

肝細胞癌是目前全球范圍內發病率較高的惡性腫瘤之一，術后伴有不良反應的患者5年生存率只有5%左右[1]。主要原因是晚期肝細胞癌的手術機會小，術后復發率高，導致肝細胞癌患者的治療現狀改善不明顯[2-3]。探討研究肝細胞癌的分子發病機制是研究臨床治療的熱點方向。miRNA是由20～22個核苷酸組成的非編碼RNA，通過特異性結合和切割信使RNAs(mRNAs)，抑制mRNA翻譯和脫氨基化來抑制其同源靶基因的表達[4]。miRNA已被認為是惡性腫瘤發生的調節因子。miRNA表達的異常調節在惡性腫瘤細胞的轉移過程中經常存在明顯的表達差異[5]。另一方面，miRNA的異常表達與肝癌的發展相關[6]。例如，miR-122、mi-26a及miR-195已經被鑒定為肝臟中的腫瘤抑制劑，而miR-21和miR-221可以促進肝細胞癌變[7]。上皮間質轉化行為的特征是細胞黏附性的喪失，上皮細胞黏附蛋白E-鈣粘著蛋白、N-鈣粘蛋白和波形蛋白的下調，可以直接干擾影響[8]。據相關研究證實，上皮間質轉化行為可直接促進惡性腫瘤進展，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移，并誘導腫瘤抗藥性的產生[9]。然而，miR-194在肝細胞的進展和上皮間質轉化中的作用一直沒有得到很好的驗證。

miR-194在肝臟中的表達差異被發現很久，但其具體功能機制尚未明確。有研究表明miR-194在腸上皮細分化過程中可以誘導其進展[10]。在本實驗目前的研究中，首先在肝癌組織和肝癌細胞中分析miR-194的表達差異，然后通過調控鈣粘連蛋白的表達干擾其生物學行為進程，直接影響肝癌細胞的惡性轉移行為。

1 材料與方法

1.1 組織標本和細胞培養 在本地醫院獲得肺癌患者書面知情同意后，采集肝癌組織樣本和癌旁正常組織樣本，本研究獲得醫學院審查委員會的批準。蠟塊包埋的腫瘤樣品用于免疫組織化學研究。HepG2、Hep3B、SNU398和SNU475肝癌細胞購自中國武漢大學典型培養物保藏中心。細胞培養條件：10%胎牛血清補充的改良Eagle培養基，37℃，5%CO2恒溫孵箱中培育。

1.2 PCR實驗 使用mirVana miRNA分離試劑盒從肝癌組織和對照癌旁正常組織中分離總RNA。使用Nano-2000分光光度計測定RNA濃度和純度。反應條件按照cDNA合成試劑盒使用說明進行設置。反應條件：95℃預變性10min、95℃變性15s、60℃退火32s，循環50次后檢測其溶解曲線，檢測完成后，通過計算機系統自動分析各樣本Ct值，然后采用2-ΔΔCt計算miRNA的相對表達量。實驗重復3次。miR-194引物序列：5’-GTAGCGGTAGCGGATGCGGAGC-3’(正向)和5’-GGATCTATCCCCTAGCGAGTAGGGC-3’(反向)。

1.3 蛋白質印跡測定 使用RIPA緩沖液提取總細胞裂解物，通過配置12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，并轉移到PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉，并在4℃下與一抗(濃度1∶1 000)一起孵育過夜。 隨后，將膜與二抗孵育，最后用ECL底物試劑盒檢測，實驗重復3次。

1.4 劃痕愈合實驗 劃痕愈合實驗通過將肝癌細胞接種到六孔板上進行測定。在肝癌細胞附著于平板并達到100%匯合后，使用無菌吸頭通過匯合單層進行刮擦。觀察細胞遷移到劃痕區域的細胞距離，并拍攝照片，并且對5個隨機選擇的區域進行統計分析。實驗重復3次。

1.5 Transwell侵襲實驗 Transwell侵襲實驗檢測肝癌細胞的侵襲能力。在含有0.1%牛血清白蛋白的無血清培養基中將肝癌細胞加入到上室中，通過基質膠侵入下室的細胞數量用結晶紫染色劑染色，并在37℃，5%CO2下孵育24～36h后計數。觀察細胞侵襲到下層小室區域的細胞數目，并拍攝照片，并且對5個隨機選擇的區域進行統計分析。實驗重復3次。

1.6 裸鼠體內成瘤實驗 裸鼠成瘤實驗：將不同組的2×107的肝癌細胞分別離心，用50μl PBS稀釋重懸待用。10只4周左右的裸鼠，分為miR-194-inhibitor組和NC組，每組5只，將兩組肝癌細胞分別注射入左側腋下，2周觀察腫瘤形成情況。6周后將腫瘤剝除，將腫瘤組織包埋切片進行檢測。

1.7 統計學方法 所有統計分析均使用SPSS17.0(SPSS，Chicago，USA)進行。 數據以均數±標準差表示，統計學分析采用Student’st檢驗。 使用Pearson相關分析來估計CCAT1和miR-410的表達水平之間的關系。P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-194在不同肝癌細胞中的表達水平 通過qPCR實驗檢測miR-194在肝癌組織中的表達情況。qPCR結果顯示：miR-194在肝癌組織中表達水平明顯高于癌旁正常組織(1.28±0.16 VS 0.37±0.03)，差異具有統計學意義(P<0.05)。細胞株中結果顯示：miR-194在HepG2肝癌細胞中的表達最高，后續實驗選取HepG2肝癌細胞作為實驗細胞株。見圖1。

圖1 miR-194在肝癌組織和細胞株中的表達情況

2.2 miR-194調控鈣粘蛋白的表達水平 通過Western blotting實驗檢測miR-194對肝癌細胞中鈣粘蛋白的表達水平的影響。實驗結果顯示(圖2)：轉染了miR-194-inhibitor后，E-Cadherin，N-Cadherin和Vimentin蛋白的表達水平相比NC組均明顯降低(1.81±0.22 VS 0.52±0.08，2.96±0.39 VS 0.51±0.09，2.06±0.24 VS 1.62±0.22)，差異具有統計學意義(P<0.05)。表明抑制miR-194后可以調控相關鈣粘蛋白的表達，從而干擾肝癌細胞上皮間質轉化過程。

圖2 miR-194對鈣粘蛋白表達水平的影響情況

2.3 miR-194對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響 劃痕愈合實驗檢測結果顯示(圖3)，與NC對照組相比，抑制miR-194后72h肝癌細胞的遷移能力得到一定程度的減弱[(82.6±15.3)%VS(29.1±8.2)%]，差異具有統計學意義(P<0.05)； Transwell侵襲實驗結果顯示，與NC對照組相比，抑制miR-194后肝癌細胞的侵襲能力得到一定程度的減弱[(332.6±29.4)%VS(136.8±16.4)%]，差異具有統計學意義(P<0.05)。表明抑制miR-194的表達對肝癌細胞的遷移和侵襲運動能力有一定的抑制作用。

2.4 miR-194對肝癌細胞體外成瘤能力的影響 兩組小鼠在肝中的轉移灶不明顯，對轉移灶腫瘤組織進行蘇木精—伊紅染色的組織切片。結果如圖4所示，抑制miR-194的表達后可以在一定程度上降低裸鼠體內中腫瘤轉移灶的數量和大小。表明抑制miR-194的表達可以干擾肝癌細胞的生長發展進程。

圖3 miR-194對肝癌細胞遷移和侵襲能力的影響

圖4 蘇木精—伊紅染色裸鼠肝癌轉移灶的情況

3 討論

雖然miR-194在肝臟中的高表達情況早已證明，但其相關功能機制了解不甚清楚。兩項關于人上皮細胞分化和肝纖維化的研究揭示了miR-194的可能功能行為。因為這兩個過程涉及上皮細胞和間充質細胞之間的相互作用或轉換，筆者推測miR-194可能在肝上皮細胞中特異性表達并在模仿EMT的分化過程中的調控作用。進一步確定miR-194在上皮細胞中的一個潛在作用是調控E-Cadherin和N-cadherin的表達并阻礙EMT期間的鈣粘蛋白轉換。從而使肝癌細胞系中miR-194的表達降低下調N-cadherin的表達并抑制了細胞的遷移和侵襲過程[11]。另外有相關研究表明miR-194的過度表達可能會逆轉某些細胞情況下的細胞分化狀態，可能是通過釋放間充質細胞中E-鈣粘蛋白的轉錄或翻譯抑制[12]。盡管這些結果并不能在完全意義上證實過程，但是揭示了miR-194在維持腫瘤細胞上皮表型和預防EMT過程中潛在的作用[13-14]。

筆者的研究結果表明，miR-194可能特異性地抑制E-鈣粘蛋白表達和N-鈣粘蛋白表達，但對Vimentin蛋白沒有直接的影響作用。在臨床情況下，轉移性細胞并不總是需要完整的上皮間質轉化過程發揮作用，因為Vimentin在許多轉移性腫瘤中表達差異不明顯。此外，雖然Vimentin蛋白的喪失被認為是上皮間質轉化的標志之一，但E-鈣粘蛋白表達和N-鈣粘蛋白可能是通過增強腫瘤細胞的遷移和轉移的必需因子[15]。所以如果E-鈣粘蛋白表達和N-鈣粘蛋白的外源表達有明顯差異，無論Vimentin的表達如何，肝癌細胞都能促進遷移和侵襲[16]。此外，有報道認為N-鈣粘蛋白可以促進原發性肝癌的生長，并對肝癌細胞發揮抗凋亡作用[17]。因此，miR-194調控E-cadherin和N-cadherin可能在腫瘤發展過程中發揮重要和多方面的作用

綜上所述，miR-194可能通過調控鈣粘蛋白的相關表達直接影響肝癌細胞的上皮間質轉化過程，從而直接干擾肝癌細胞的遷移和侵襲行為，本研究結果表明，miR-194是一種潛在的肝癌上皮細胞的miRNA標記，并且在原發性肝癌細胞中起著抗轉移的作用。 因此，miR-194可能是肝癌的預后和治療的潛在靶標。