HPLC-ELSD法測定硫酸慶大霉素片的組分和有關物質

王立萍 姚永青 梅芊 李楊 劉英

(河南省食品藥品檢驗所，鄭州 450008)

慶大霉素為美國Schering公司Weinstein等[1]于1963年發現，1966年其硫酸鹽應用于臨床，1965年我國中科院福建微生物研究所分離得到產生菌，1969年經研制成功后并投入生產[2]，早期劑型為注射劑。由于硫酸慶大霉素口服基本不吸收，但在腸道中能達高濃度，片劑和顆粒劑開始上市，臨床應用于治療細菌性痢疾或其他細菌性腸道感染，亦可用于結腸手術前準備。

硫酸慶大霉素片目前僅國內生產，包括素片、薄膜衣片及糖衣片。其口服吸收性差，在胃腸道中濃度較穩定而持久，主要以原型隨糞便排出。慶大霉素主要由C1、C1a、C2和C2a4個活性成分組成，另外還有次要組分如西索米星、慶大霉素C2b等[3]。各組分的毒性和抗菌能力有一定的差異[4]，各組分相對含量的變化關系著產品的療效和毒副作用，為保證藥物使用的安全性、有效性，應對硫酸慶大霉素組分和有關物質進行控制。硫酸慶大霉素注射液，伴隨著藥典標準的不斷完善與提高，其嚴重不良反應明顯降低[5]。

中國藥典2015年版二部收載硫酸慶大霉素片[6]，國外藥典均未收載該劑型。中國藥典2015年版二部收載的硫酸慶大霉素原料和注射液均采用HPLC-ELSD法控制其組分和有關物質[7]，而未對片劑的組分和有關物質進行控制，這就存在使用劣質的原料進行片劑生產的風險。本文在中國藥典2015年版二部硫酸慶大霉素注射液組分和有關物質測定方法的基礎上，建立了硫酸慶大霉素片的組分和有關物質測定方法，該方法專屬性好，可有效控制硫酸慶大霉素片的組分和有關物質，防止企業采用劣質原料生產片劑。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695液相色譜儀，Empower色譜工作站(美國Waters公司)，Alltech 2000ES ELSD檢測器(Alltech公司)。BP-211D分析天平(Mettler公司)。

1.2 試藥

慶大霉素標準品，批號：130326-201015，C114.7%、C1a15.3%、C2a8.5%、C218.5%；小諾霉素標準品，批號：130342-201404，563u/mg(51.8%)；西索米星對照品，批號：130635-201301，56.0%，標準物質均來源于中國食品藥品檢定研究院。三氟乙酸為色譜純(J&K 99.9%，L130Q156，北京百靈威科技有限公司)，甲醇為色譜純(德國Merck)，水為Mill-Q去離子水。

1.3 樣品

156批樣品來源于2017年國家評價性抽驗樣品，其中12批素片，27批薄膜衣片，117批糖衣片，規格均為40mg(4萬單位)。涉及生產企業11個，分別以數字1～11表示。

2 方法

2.1 儀器方法

色譜柱為GRACE Apollo C18(250mm×4.6mm,5μm)。流動相為0.2mol/L三氟乙酸溶液:甲醇(96:4)，流速0.6mL/min；柱溫35℃；進樣量25μL(慶大霉素C組分)和50μL(有關物質)；ELSD漂移管溫度110℃，載氣流速2.5L/min，增益1。

2.2 測定方法

慶大霉素C組分：精密稱取慶大霉素標準品適量，加水溶解稀釋成約含慶大霉素總C組分0.4、1.0和2.0mg/mL的溶液，作為標準品溶液(1)、(2)、(3)。精密量取上述3種溶液各25μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算標準品溶液各組分濃度對數值與相應峰面積對數值的線性回歸方程，相關系數(r)應不小于0.99；另取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于慶大霉素0.1g)；如為糖衣片，取5片，全部研細，加水溶解并定量稀釋制成約含慶大霉素1.0mg/mL的溶液，同法測定，用慶大霉素各組分的線性回歸方程分別計算供試品中對應組分的量(Ctcx)，并按下面公式計算出各組分的含量(%, u/u)：

Cx=(Ctcx×V×理論效價×平均片重)/(W×標示量)×100%(薄膜衣片與素片)；Cx(%)=(Ctcx×V×理論效價)/(標示量×5)×100%(糖衣片)。

式中Cx為慶大霉素各組分的含量(%, u/u)；Ctcx為由回歸方程計算出的各組分的含量(mg/mL)；V為供試品、溶液的體積(mL)；W為供試品稱重(g)；標示量以u計。

理論效價：C1739.6u/mg、C1a1287.0u/mg、C2a1079.5u/mg和C21095.7u/mg。

有關物質：精密稱取西索米星對照品和小諾米星標準品各適量，加水溶解并定量稀釋制成約含西索米星和小諾米星各10、20和40μg/mL的溶液，作為標準品溶液(1)、(2)、(3)。按照慶大霉素C組分項下的色譜條件試驗，精密量取標準品溶液(1)、(2)、(3)各50μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算標準品溶液濃度對數值與相應峰面積對數值的線性回歸方程，相關系數(r)應不小于0.99；另取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當于慶大霉素0.1g)；如為糖衣片，取5片，全部研細，加水溶解并定量稀釋制成約含慶大霉素1.0mg/mL的溶液，同法測定，記錄色譜圖至慶大霉素C1峰保留時間的“1.2”倍，供試品溶液色譜圖中如有西索米星峰、小諾米星峰，用相應的線性回歸方程計算西索米星、小諾米星的含量。除硫酸峰和輔料峰外，其他雜質峰按西索米星線性回歸方程計算，供試品溶液色譜圖中小于0.1%的雜質峰忽略不計。

3 結果

3.1 專屬性

精密量取空白溶液(水)50mL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果空白溶液對慶大霉素各C組分峰及有關物質峰均無干擾。

按處方比例分別稱取硫酸慶大霉素素片、薄膜衣片、糖衣片輔料適量，按有關物質供試品溶液制備方法配制，得相當于慶大霉素濃度為1.0mg/mL的輔料溶液，量取50μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至慶大霉素C1峰保留時間的1.2倍，結果各輔料均在5.0min之前響應，只有糊精在約5.7和6.7min有響應，但與組分和有關物質能有效分離。扣除輔料峰計算，不干擾組分和有關物質測定，見圖1。

圖1 硫酸慶大霉素片空白輔料色譜圖Fig.1 Blank chromatogram of gentamicin sulfate tablets

考察專屬性所用輔料：玉米淀粉、明膠、硬脂酸鎂、滑石粉、二氧化硅、糊精、糖粉(蔗糖)、蟲白蠟、檸檬黃、預膠化淀粉、微晶纖維素、羥丙甲纖維素、聚丙烯酸樹脂Ⅳ、聚乙二醇6000、川蠟、硫酸鈣、聚山梨酯80、十二烷基硫酸鈉、薄膜衣包衣輔料(混合)。

3.2 系統適用性

取慶大霉素標準品適量，精密稱定，加水溶解稀釋成約含慶大霉素1.0mg/mL的溶液，量取50μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至慶大霉素C1峰保留時間的1.2倍。結果系統適用性溶液色譜圖與中國藥典2015年版中慶大霉素標準圖譜一致，西索米星、慶大霉素C1a、慶大霉素C2、小諾米星、慶大霉素C2a各峰之間分離度均不小于1.5(圖2)。

3.3 線性與范圍

圖2 系統適用性試驗色譜圖Fig.2 Chromatograms in system suitability test

精密稱取慶大霉素標準品43.98mg，置于10mL容量瓶中，用水溶解后稀釋至刻度，精密量取適量，配制成濃度分別為0.352、0.880、1.759、2.639、3.518和4.398mg/mL的溶液，作為慶大霉素C組分的線性溶液。精密量取上述溶液各25mL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據慶大霉素標準品各C組分的絕對含量及上述線性溶液中慶大霉素的濃度，分別計算慶大霉素各C組分的絕對濃度C(mg/mL)，計算各C組分的絕對濃度對數值與相應峰面積對數值的線性回歸方程，結果慶大霉素4個C組分均線性關系良好(表1)。

表1 慶大霉素各C組分線性結果Tab.1 Linear results of the C components of gentamicin

3.4 檢測限與定量限

精密稱取西索米星對照品9.08mg、小諾米星標準品10.22mg，加水溶解并稀釋至100mL，得溶液50μg/mL的溶液；精密量取該溶液2.5mL(50μg/mL)，加水稀釋至10mL，得溶液12.5μg/mL，作為檢測限溶液。西索米星檢出限以S/N=3計為88.98ng，定量限以S/N=10計為127.12ng。小諾米星檢出限以S/N=3計為132.35ng，定量限以S/N=10計為264.70ng。

3.5 準確度

根據企業1提供的處方和輔料，按照處方比例和硫酸慶大霉素片量的80%、100%和120%精密稱取慶大霉素標準品適量，配制準確性試驗供試品溶液。各濃度平行配制3份。精密量取25μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。

精密稱取慶大霉素標準品適量，加水溶解稀釋成約含慶大霉素總C組分0.4、1.0和2.0mg/mL的溶液，作為標準品溶液(1)、(2)、(3)。精密量取上述3種溶液各25μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。計算標準品溶液濃度各C組分濃度對數值與相應峰面積對數值的線性回歸方程，相關系數(r)應不小于0.99。用慶大霉素各C組分的線性回歸方程分別計算供試品中對應組分的量，計算出各C組分的回收率(%)。各C組分的平均回收率均良好(表2)。

3.6 精密度

儀器精密度：將有關物質測定項下小諾米星標準品溶液(約40μg/mL)，連續進樣5次，小諾米星峰面積的RSD為0.5%。表明該方法精密度良好。

表2 回收率試驗結果Tab.2 Results of recovery test

中間精密度：取同一批號(批號為150901)供試品，分別由兩名分析人員于3d按擬定的慶大霉素C組分和有關物質測定的方法測定，結果供試品溶液中慶大霉素C1a、慶大霉素C2、慶大霉素C2a、慶大霉素C1含量的RSD分別為1.7%、1.2%、1.9%和1.7%；西索米星、小諾米星、其他最大單個雜質、其他雜質總量的RSD分別為3.0%、1.7%、3.3%和3.2%，表明該方法中間精密度良好。

3.7 重復性

慶大霉素C組分：取同一批號(批號：2161020)供試品，按擬定的慶大霉素C組分測定的方法測定，結果供試品溶液中慶大霉素C1a、慶大霉素C2、慶大霉素C2a、慶大霉素C1含量的RSD分別為0.8%、1.2%、0.9%和0.9%，表明該方法重復性良好。

有關物質：取同一批號(批號：2161020)供試品，照擬定的有關物質測定方法測定，結果供試品溶液中西索米星、小諾米星、其他最大單個雜質、其他雜質總量的RSD分別為2.4%、2.5%、3.8%和5.8%，表明該方法重復性良好。

4 樣品測定結果

采用擬定的方法測定156批次硫酸慶大霉素片的組分，148批次樣品的測定結果為：C1a為26.2%～37.5%，C2+C2a為41.2%～50.9%，C1為17.1%～23.4%，4個組分總含量為93%～105%，結果良好。企業3和企業4的8批次樣品，總組分含量均偏低。采用中國藥典2015年版二部硫酸慶大霉素片含量測定方法-微生物檢定法測定該兩企業的8批次樣品的效價含量，結果均高于HPLC-ELSD法測定的總組分含量(表3)。圖3為供試品溶液慶大霉素C組分的典型色譜圖。

148批次樣品的有關物質測定結果：小諾米星為1.3%～2.6%，西索米星為0%～1.6%，最大單雜為0.3%～1.1%，總雜為1.2%～4.3%。另外企業3和企業4的8批次樣品的西索米星、最大單雜、總雜均偏高(表4)。圖4為供試品溶液有關物質的典型色譜圖。

5 討論

慶大霉素C組分測定方法的進樣體積定為25μL，是因為進樣體積50μL時，組分測定項下慶大霉素標準品溶液(約0.4mg/mL)色譜圖中慶大霉素組分C1a峰將平頂，無法積分，故降低進樣量。

本文建立的HPLC-ELSD法測定硫酸慶大霉素片的組分和有關物質，采用高比例水相，低pH值的流動相，其pH值約為0.9，需采用耐酸且適合高比例水相的色譜柱。

表3 企業3和企業4的樣品測定結果Tab.3 Results of sample determination for enterprises 3 and 4

圖3 供試品溶液C組分典型色譜圖Fig.3 Chromatograms of C components for test solution

表4 有關物質測定結果Tab.4 Results of related substances

圖4 供試品溶液有關物質典型色譜圖Fig.4 Chromatography of related substances for test solution

中國藥典2015年版二部采用抗生素微生物檢定法測定硫酸慶大霉素片的含量，未對其慶大霉素C組分和有關物質進行控制。抗生素微生物檢定法影響因素較多，由于其原理是量-反應平行線原理[8]，要求標準品與供試品有同質性，即對多組分抗生素，標準品和供試品中各組分的相對比例要一致，而實際中標準品與各企業的樣品的組分相對比例均不一致，測得的結果會存在誤差。另外微生物檢定法測得結果是主成分和有關物質的綜合含量，不能真實反映主成分的含量。本文采用微生物檢定法測定兩企業的8批次樣品的效價含量，結果均高于本文擬定方法測定的總組分含量，是由于擬定方法測定的是硫酸慶大霉素片4個C組分的總標示含量，而微生物檢定法測定的是4個C組分及所有有關物質的綜合活性。

如果參考中國藥典2015年版二部硫酸慶大霉素注射液組分和有關物質的標準規定，該8批次樣品的組分和有關物質測定結果是不符合標準規定的。因此如果不對片劑的組分和有關物質進行控制，則存在采用劣質原料生產出符合藥典標準規定的片劑風險。