柱后衍生化-HPLC法檢測硫酸新霉素的有關物質

張楊慧 蔣孟虹 趙敬丹 秦峰,3 劉浩,*

(1 中國醫藥工業研究總院，上海 201203；2 上海市食品藥品檢驗所，上海 201203；3 復旦大學化學系，上海 200433)

新霉素(neomycin)是首個被發現的2-脫氧鏈霉胺雙取代氨基糖苷類抗生素[1]。由于硫酸新霉素的有關物質較多[2](圖1)，雜質(如新霉胺)一般活性較低且具有一定的毒性，會影響臨床療效，導致不良反應，因此對新霉素進行有關物質的檢測是產品質量控制十分重要的環節。

新霉素及其有關物質缺乏特征的紫外吸收，中國藥典2015年版[3]采用TLC法僅控制新霉胺限度。歐洲藥典9.0版[2]收載的硫酸新霉素有關物質檢測方法為HPLC-脈沖安培檢測(PAD)法，流動相為三氟乙酸溶液，但此方法并不能將雜質LP-B與新霉素B分離，且新霉胺與雜質LP-A不能完全分離[5]。雖然Hoogmartens等[4-5]改進了歐洲藥典方法，但該類分析系統價格昂貴，對操作人員的技能要求較高，不利于檢測方法的普及。國內外文獻報道硫酸新霉素的有關物質分析方法還有HPLC-蒸發光散射檢測(ELSD)法[6-7]，柱前衍生化-HPLC法[8-9]，LC-MS法[10-13]等。ELSD具有通用性強、維護要求低等優點，但其要求流動相具有揮發性，這使得色譜分離系統的優化受到較大的限制。柱前衍生化法通常采用的衍生化試劑為鄰苯二甲醛，茚三酮等，但該方法操作繁瑣，且柱前衍生物不穩定，易發生熒光淬滅。文獻報道兩種LC-MS法，第一種[10]采用三氟乙酸/五氟丙酸色譜系統分離，但該流動相中的多氟羧酸會抑制質譜離子化效率。第二種[11-13]是采用HILIC柱，但該色譜柱無法將新霉素及其有關物質有效分離，僅在血漿，動物的藥物殘留檢測中應用較多。

本文參考文獻[5]采用分離能力較強的離子對HPLC分離系統，新建了硫酸新霉素有關物質檢查的柱后衍生化-HPLC-熒光檢測法。該方法操作簡便，靈敏度高，不僅提高了色譜分離能力，同時避免了昂貴的電化學檢測器的使用，有利于方法的普及，可作為新霉素有關物質檢測的常規方法。本文同時將新建HPLC分離系統與電化學檢測器聯用，并對兩種方法進行了比較。

1 儀器與材料

儀器：Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent 1100熒光檢測器，Pickering PCX5200柱后衍生化系統，ICS-5000+型離子色譜儀(Thermo Scientific)，Waters 2767/2545/SFO制備液相色譜儀。

圖1 新霉素及其主要雜質結構Fig.1 Structures of neomycin and its chief impurities

庚烷磺酸鈉一水合物(色譜純)由東京化成工業株式會社提供；乙腈和甲醇(色譜純)由Merck公司提供；冰醋酸、無水硫酸鈉、硼酸、氫氧化鈉和2-巰基乙醇(分析純)均由上海凌峰化學試劑有限公司提供；鄰苯二甲醛(色譜純)由北京百靈威科技有限公司提供；水為純化水。電化學檢測系統采用的無水硫酸鈉由SIGMA提供，50%氫氧化鈉溶液由ACROS提供。

硫酸新霉素標準品(批號：130309-200811，中國食品藥品檢定研究院)；硫酸新霉素對照品(批號：45800，USP對照品)；硫酸新霉素對照品(批號：N0400000，Batch3.7歐洲藥典)；弗萊菌素(新霉素B組分，華曙制藥集團)；新霉素C(華曙制藥集團)；新霉胺(批號：30411-200908，中國食品藥品檢定研究院)；核糖霉素(批號：3489301，中國食品藥品檢定研究院)；巴龍霉素I(paromomycin sulfate批號：6-EOD-120-1，Toronto Research Chemicals)；巴龍霉胺(批號：P195340，Toronto Research Chemicals)；硫酸新霉素(批號：N-9209-56、N-9301-1、N-9705-113B、N-9704-107A，上海新亞藥業有限公司)。

2 方法

2.1 色譜分離系統

2.1.1 柱后衍生化-HPLC法色譜系統

色譜柱：COSMOSIL 5C18-PAQ(4.6mm×250mm,3.5μm)；流動相A：pH3.4緩沖液[取庚烷磺酸鈉一水合物4.35g和無水硫酸鈉16g，加水溶解并稀釋至1000mL，用冰醋酸調節pH值至(3.4±0.1)]-乙腈(95:5)；流動相B：pH3.4緩沖液-乙腈(60:40)；按表1進行線性梯度洗脫；流速：1.0mL/min；柱溫30℃；進樣體積：5μL。

柱后衍生系統：衍生化試劑[取鄰苯二醛0.8g、甲醇300mL、2-硫基乙醇2mL和硼酸鹽緩沖液(稱取72.0g硼酸和43.0g氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至4000mL，用1mol/L硼酸溶液或1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至10.4±0.1)700mL，混勻，用0.45μm濾膜濾過]的流速為0.3mL/min。

熒光檢測器：激發波長：340nm，發射波長：455nm。

2.1.2 HPLC-PAD法色譜系統

同柱后衍生化法-HPLC的色譜分離條件，進樣體積為25μL。

柱后堿溶液(量取超純水974mL，氦氣脫氣10min后，量取50%氫氧化鈉溶液26mL，混合，繼續通氦氣脫氣2min即得)；流速為0.3mL/min。

2.2 溶液的配制

2.2.1 柱后衍生化-HPLC法

系統適用性溶液：取國產硫酸新霉素對照品約39mg，置于50mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得(0.5mg/mL)(圖2A)。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedures

供試品溶液：取硫酸新霉素適量，加水溶解并稀釋制成濃度為0.5mg/mL的溶液。

2.2.2 HPLC-PAD法

系統適用性溶液：取國產硫酸新霉素對照品約23mg，置于100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得(0.15mg/mL)(圖2B)。

供試品溶液：取硫酸新霉素適量，加水溶解并稀釋成濃度為0.15mg/mL的溶液。

3 方法學考察

3.1 專屬性

取硫酸新霉素約78mg，精密稱定，置于10mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為樣品貯備液(5mg/mL)；酸破壞試驗：取樣品貯備液1mL，加2mol/L鹽酸0.5mL，混勻，室溫放置18h，加2mol/L氫氧化鈉溶液0.5mL中和。堿破壞試驗：取樣品貯備液1mL，加2mol/L氫氧化鈉0.5mL，混勻，室溫放置18h，加2mol/L鹽酸溶液0.5mL中和。氧化破壞試驗：取樣品貯備液1mL，加30%雙氧水1mL，混勻，室溫放置1h。高溫破壞試驗：取樣品貯備液1mL，于105℃高溫放置8h。光照破壞試驗：取樣品貯備液1mL，于254和365nm紫外光放置18h。分別將上述破壞樣品用純水稀釋制成約含新霉素0.5mg/mL的溶液。按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析。色譜圖如圖3所示。主峰與降解雜質峰之間均分離良好，新建方法的專屬性良好。

3.2 重復性

精密稱取同一批號(N-9705-113B)的硫酸新霉素6份，加水溶解并稀釋制成約含新霉素0.5mg/mL的溶液，進樣分析，按面積歸一化法計算，新霉胺均為0.8%；核糖霉素的平均值為0.8%，RSD為0.02%(n=6)；巴龍霉素I的平均值為1.45%，RSD為0.02%(n=6)；雜質總量的平均值為7.6%，RSD為0.3%(n=6)，該方法重復性良好。

圖2 系統適用性溶液典型色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram for system suitability solution

圖3 專屬性試驗色譜圖Fig.3 HPLC Chromatograms for specificity test

3.3 檢測限(LOD)與定量限(LOQ)

本方法的LOD和LOQ按新霉素B峰的信噪比3:1和10:1計，分別為1.1和3.5ng。

3.4 穩定性

取批號為N-9705-113B的供試品溶液，在18h內每隔6h進樣1次，最大雜質峰面積的平均值為1.46%，RSD為0.03%(n=3)；雜質總量的平均值為7.5%，RSD為0.23%(n=3)，表明供試品溶液在18h內穩定。

3.5 耐用性

分別考察了供試品溶液在Cosmosil C18-PAQ、Zorbax Eclipse plus C18、TSKGEL ODS-100S C18、XBridge C184種不同品牌填料的色譜柱上的分離情況，各雜質之間以及與新霉素B和新霉素C之間均能得到有效分離，說明本方法的耐用性較好。

4 樣品測定

采用柱后衍生化-HPLC法對4批硫酸新霉素以及國產與進口對照品按”2.1.1”項下色譜條件及”2.2.1”項下樣品濃度進行有關物質檢查，按歸一化法計算，結果表明，國產硫酸新霉素雜質總量(5.1%～12.3%)大于進口對照品的雜質總量(0.7%～3.8%)，同時采用HPLC-PAD法按”2.1.2”項下色譜條件及”2.2.2”項下樣品濃度進樣分析(表2)。

5 討論

5.1 分離條件優化

本文采用含烷基磺酸鹽的離子對HPLC系統，分別考察了己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉和辛烷磺酸鈉3種離子對試劑對分離的影響。結果顯示，采用相同濃度的己烷磺酸鈉，則保留較弱，有關物質在10min內全部洗脫，且幾乎均未分離；采用辛烷磺酸鈉則保留過強，新霉素B在60min后才洗脫。考慮到分析時間的合理性，選擇了庚烷磺酸鈉作為離子對試劑。

考察了不同濃度庚烷磺酸鈉(5、10和20mmol/L)對色譜分離的影響。濃度較低時(5和10mmol/L)，新霉素C與其前相鄰雜質共洗脫。濃度為20mmol/L時，各峰之間分離較好，最終確定庚烷磺酸鈉濃度為20mmol/L?？疾炝瞬煌瑵舛攘蛩徕c(20、60和110mmol/L)對色譜分離的影響。濃度越高，保留時間越短。綜合考慮分離度，分析時間合理性，確定硫酸鈉濃度為110mmol/L。

表2 有關物質檢測的結果Tab.2 The results of the related substances detection

采用冰醋酸調節緩沖液pH值，考察了pH3.2、3.4、3.8和5.7條件下新霉素B及其有關物質的分離情況。pH在3.2～5.7范圍內，pH值對新霉素及其有關物質之間的分離影響極小，pH3.4時，新霉素C與其前相鄰雜質具有較高的分離度，新霉素B峰對稱性較好。故確定緩沖液pH值為(3.4±0.1)。

考察了流動相中添加乙腈或甲醇對分離的影響。結果顯示，采用乙腈可獲得更好的分離和更高的柱效，故選擇乙腈作為有機改性劑。

考察了色譜柱溫對分離的影響，結果顯示，降低柱溫不僅可改善分離，也可改善新霉素C與其前相鄰雜質之間的分離，但柱溫降低至20～25℃時，峰形拖尾嚴重，保留時間過長，故選擇柱溫為30℃。

5.2 雜質LP-A和LP-B確認

采用制備液相，分別制備HPLC-柱后衍生系統中保留時間約為12和37min的雜質，氮吹富集后，采用文獻[5]的HPLC-PAD系統進行確認。結果顯示收集的雜質與文獻中的雜質LP-A和雜質LP-B峰對應，推斷保留時間約為12min的雜質為LP-A，37min的雜質為LP-B。

5.3 HPLC-PAD法與柱后衍生化-HPLC法比較

5.3.1 檢測方法的比較

鄰苯二甲醛(OPA)與氨基糖苷類抗生素的衍生化反應位點為伯氨基，如果目標物中不含伯氨基基團，則無法進行衍生化，從而不會被紫外活熒光檢測器檢測到[14]。HPLC-PAD法采用脈沖安培檢測器(四電位波形)，電活性分子的羥基在工作電極表面發生氧化還原反應，從而產生電極信號而被檢測到。

實驗結果顯示，兩批樣品(批號：N-9209-56、N-9705-113B)分別在柱后衍生化-HPLC與HPLC-PAD系統中檢出的雜質個數相同，即HPLC-PAD系統中檢測到的雜質在柱后衍生化-HPLC系統中均可檢測到，但兩種方法的檢測結果存在差異，這與兩種檢測方法的檢測原理不同有關(圖4和表2)。

5.3.2 靈敏度比較

HPLC-PAD法的檢測限按新霉素B峰的信噪比3:1計，約為1.0ng，與柱后衍生化-HPLC法檢測限(1.1ng)相近。柱后衍生化-HPLC法與HPLC-PAD法均具有較高的靈敏度。

5.3.3 實驗條件比較

HPLC-PAD法對實驗人員的操作技能要求較高；PAD的電極易鈍化，需要經常清洗，且清洗電極之后分析系統需要較長的平衡時間[15]；實驗用到的水和試劑均不得含有電化學活性雜質。而柱后衍生化-HPLC法在儀器及試劑等方面要求較低，具有更好的普適性。

6 結論

本文建立的柱后衍生化-HPLC-熒光檢測法操作簡便、分離能力強，準確度和精密度均較好，適用于硫酸新霉素有關物質的檢測。

圖4 兩種分析系統分析硫酸新霉素的圖譜Fig.4 The results of analysis of sulfate neomycin with two analytical systems