羥基紅花黃色素A對卵巢癌細胞PI3K/Akt信號通路的影響

梁若笳應家樂 朱 磊

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的腫瘤，術后以順鉑為基礎的聯合化療是目前的基礎治療。化學增敏和預防治療抗性具有重要的臨床意義。近來研究發現，卵巢癌細胞耐藥性的發展與上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）密切相關，而 MAPK/ERK、PI3K/ART、PKC/GSK-3β 等多條信號通路均參與調控腫瘤細胞EMT，其中PI3K/Akt信號通路是細胞外信號向細胞內傳導的重要途徑，與卵巢癌的發生、發展密切相關[1-2]。羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA）是中藥紅花的水溶性提取物，具有誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤轉移的雙重作用，但具體機制尚不明確[3]。本研究旨在觀察HSYA在逆轉A2780/DDP的順鉑耐藥中的作用及對PI3K/Akt信號通路的影響，探討HSYA逆轉卵巢癌順鉑耐藥的分子機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 健康BALB/C雌性裸鼠20只，3～4周齡，體質量18.0～20.0g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司 [實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2013-0016]。SPF條件下飼養于浙江省實驗動物中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2014-0008]，溫度（24±2）℃，濕度（55±5）%，每 12h予亮暗循環，2周更換1次敷料，用無菌水及飼料飼養。

1.2 細胞株 順鉑耐藥人卵巢癌細胞株A2780/DDP，購于中科院上海細胞庫。

1.3 實驗藥物及試劑 HSYA購于江蘇江陰天江藥業有限公司，批號146087-19-6，純度：＞98%；DDP購于德州德藥制藥有限公司，批號37020523；RPMI 1640培養基，批號61870044、DMEM培養基，批號10569044、胰酶，批號25200072均購于Gibco公司；胎牛血清，批號51342購于Hyclone公司；磷酸鹽緩沖液 （phosphate buffered saline，PBS），批號 0061購于福州邁新生物技術有限公司；ECL Plus試劑盒，批號1705060購于Bio-Rad公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，批號P0015L、RIPA細胞裂解液，批號P0013B、BCA蛋白濃度測定試劑盒，批號P0009均為碧云天公司產品；Tris堿，批號10708876001購于Sigma 公司；兔抗 Akt，批號 9272、兔抗 p-Akt，批號81283、兔抗GAPDH批號2118S均購于CST公司。

1.4 實驗器材與設備 3111型二氧化碳培養箱為Thermo公司產品；RM2135型輪轉式切片機、HI1210型攤片機、HI1220型烘片機均為Leica公司產品；BH2型顯微鏡購于Olympus公司；BM-1000型光學顯微鏡購于南京江南永新光學有限公司。1681130-4B型酶標儀、Mini-Proten Tetra System型電泳系統和ChemiDocTMTouch Imaging System型凝膠成像儀均購于Bio-Rad公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 A2780/DDP細胞培養于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100ng/mL鏈霉素和2μg/mL DDP的1640培養基中，保持培養箱溫度為37℃，CO2濃度為5%。取對數生長期細胞造模。

2.2 裸鼠移植瘤模型構建 制備單細胞懸液，調整細胞濃度至5×106個/mL，在超凈臺內對20只裸鼠進行接種。將細胞懸液注入實驗裸鼠右側腋窩皮下，每只0.2mL，待皮下移植瘤長至直徑3mm時即為順鉑耐藥卵巢癌模型鼠造模成功。

2.3 分組及藥物干預 成功接種2周后每只模型鼠皮下移植瘤體積約60mm3。采用隨機數字表將模型鼠分為對照組、紅花組、順鉑組和聯合組，每組5只。對照組以0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，紅花組予HSYA 1.1g/kg腹腔注射，順鉑組予順鉑3mg/kg腹腔注射，聯合組予 HSYA（1.1g/kg）聯合順鉑（3mg/kg）腹腔注射。每3天1次，連續給藥4周。

2.4 觀察小鼠生長情況 5周后處死小鼠，解剖取腫瘤放于電子天平稱重，記錄瘤體重量，并計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（對照組瘤體質量-實驗組瘤體質量）/對照組瘤體質量×100%。

2.5 病理觀察 取一部分腫瘤組織經甲醛固定后石蠟包埋，切片，常規HE染色后鏡下觀察腫瘤形態學改變。

2.6 Western blot檢測 取每組剩余腫瘤組織研磨，離心，使用考馬斯亮藍染料法測定蛋白濃度。用SDS-PAGE緩沖液稀釋等量蛋白，再進行10%SDS-PAGE凝膠電泳，分離的蛋白帶電轉至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶室溫封閉1h，分別用Akt、p-Akt和Gapdh單克隆抗體孵育4℃過夜。Tris緩沖液洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37℃孵育1h，Tris緩沖液洗膜，加入ECL，混勻后加在PVDF膜的表面，移入凝膠成像分析儀中，化學光敏模式曝光顯影。使用Image J軟件分析各條帶光密度。

2.6 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析，計量資料均以均數±標準差（±s） 表示，不同組間瘤重、體積等比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1 各組小鼠腫瘤HE染色結果（HE染色 200×）

圖2 HSYA對小鼠腫瘤組織內Akt、p-Akt表達的影響

3 實驗結果

3.1 各組小鼠腫瘤生長情況比較 小鼠腫瘤大體觀察，與對照組比較，順鉑組、聯合組小鼠瘤體質量明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05），紅花組小鼠瘤體質量差異則無統計學差異（P＞0.05）；與順鉑組比較，紅花組、聯合組瘤體質量差異有統計學意義（P＜0.05）；與紅花組相比，聯合組瘤體質量差異有統計學意義（P＜0.05）。與順鉑組相比，聯合組抑瘤率明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠腫瘤質量、抑瘤率比較（±s）

表1 各組小鼠腫瘤質量、抑瘤率比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與順鉑組比較，△P＜0.05；與紅花組比較，▲P＜0.05；對照組以0.9%氯化鈉溶液腹腔注射；紅花組予HSYA 1.1g/kg腹腔注射；順鉑組予順鉑3mg/kg腹腔注射；聯合組予HSYA（1.1g/kg）聯合順鉑（3mg/kg）腹腔注射；HSYA：羥基紅花黃色素A

組別對照組順鉑組紅花組聯合組鼠數 抑瘤率（%）5 5 5 5腫瘤質量（g）4.71±0.17 3.53±0.28*4.54±0.25△2.76±0.17*△▲25.08 3.61 41.36△

3.2 各組小鼠腫瘤形態學變化比較 對照組及紅花組細胞形態較為一致，核質比例高，順鉑組及聯合組出現不同程度的片狀壞死區，部分細胞出現細胞核固縮及碎裂，聯合組腫瘤壞死程度較順鉑組高。見插頁圖1。

3.3 HSYA對小鼠腫瘤組織Akt、p-Akt表達影響Western blot結果顯示，與對照組比較，順鉑組Akt、p-Akt蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），而紅花組與聯合組的Akt、p-Akt蛋白表達低于對照組與順鉑組，差異有統計學意義（P＜0.05）。HSYA可以下調Akt、p-Akt蛋白質表達。見插頁圖2、表2。

表2 各組小鼠腫瘤組織Akt、p-Akt蛋白表達比較（±s）

表2 各組小鼠腫瘤組織Akt、p-Akt蛋白表達比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與順鉑組比較，△P＜0.05；對照組以 0.9%氯化鈉溶液腹腔注射；紅花組予HSYA 1.1g/kg腹腔注射；順鉑組予順鉑3mg/kg腹腔注射；聯合組予HSYA（1.1g/kg）聯合順鉑（3mg/kg）腹腔注射；Akt：蛋白激酶 B；p-Akt：磷酸化蛋白激酶 B；HSYA：羥基紅花黃色素A

組別對照組順鉑組紅花組聯合組鼠數5 5 5 5 Akt蛋白0.61±0.11 0.62±0.09 0.42±0.10*△0.44±0.07*△p-Akt蛋白0.59±0.02 0.59±0.04 0.54±0.05*△0.56±0.05*△

4 討論

卵巢癌是女性常見癌癥，約占女性新發癌癥病例的4%[3]。目前臨床上以順鉑為主的化療是殺死卵巢癌細胞的主要手段。但化療后的獲得性耐藥是導致腫瘤復發和進展主要原因。

卵巢癌對順鉑耐藥的分子機制尚不明確，近年研究發現與EMT狀態密切有關。其中參與調控卵巢癌EMT的PI3K/AKT信號通路已被證實在多種癌癥中被激活，目前已成為研究及干預卵巢癌耐藥的熱門靶點。作為細胞生存的重要通路，PI3K/Akt信號通路在促進增殖和侵襲、抑制凋亡、促進血管生成、抵抗放化療等方面起著重要作用[4]。PI3K是一種磷脂激酶，由催化亞基（p110）和調節亞基（p85）組成，其主要下游效應物絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt，也稱為蛋白激酶，活化的Akt在調節細胞存活、增殖和凋亡中起重要作用[5]。Huang等[6]采用陣列CGH來分析卵巢癌中的遺傳畸變，確定PI3K/AKT途徑是遺傳水平上最常受影響的癌癥途徑。70%左右的卵巢癌伴有PI3K/AKT/mTOR的激活，促進過度活躍的細胞生長、增殖、生存、代謝和血管生成[7]。研究發現，Akt激活能提高卵巢癌細胞的存活，并通過衰減的p53促凋亡信號促進化學抗性[8]。Yang等[9]研究發現，PI3K/AKT對人上皮性卵巢癌順鉑耐藥有顯著影響，而抑制PI3K/AKT通路能顯著增加腫瘤細胞對順鉑的敏感性。Wang等[10]進一步發現，與單獨使用順鉑比較，聯合AKT抑制劑哌立福能顯著增加卵巢子宮內膜樣腺癌細胞凋亡，改善腫瘤控制情況。

紅花黃色素源自中藥紅花，其有效成分HSYA具有促進腫瘤凋亡、干擾血管生成、抑制轉移的作用[11]。本研究顯示，與對照組與順鉑組，紅花組小鼠的瘤體重量、抑瘤率沒有統計學差異，病理也無明顯的腫瘤凋亡，說明單純使用紅花沒有明顯抑制腫瘤的效果。然而，與順鉑組相比，同時應用順鉑和HSYA能夠有效抑制A2780/DDP的生長。Western blot結果顯示，紅花組和聯合組Akt、p-Akt蛋白均有下降。基于以上實驗結果，我們猜測，HSYA增強A2780/DDP對順鉑的敏感性、逆轉順鉑耐藥的機制在于下調PI3-K/AKT途徑的Akt、p-Akt蛋白表達。

綜上所述，本研究結果顯示HSYA可能通過下調PI3K/AKT途徑的關鍵組分Akt、p-Akt蛋白，來增強A2780/DDP對順鉑的敏感性，逆轉順鉑耐藥。關于HSYA是否會通過其他信號轉導機制抑制人卵巢癌A2780/DDP細胞生長，尚需進一步深入研究。