人臍帶沃頓膠薄片對(duì)大鼠面神經(jīng)損傷后髓鞘的修復(fù)作用

李 牧，李東朋，宋 迪，趙成斌，岳賽超，馮 杰，楊 波，關(guān)方霞

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 鄭州 450052 2)北京回龍觀醫(yī)院精神科 北京 102200

面神經(jīng)為周圍神經(jīng)重要的一支，由于其結(jié)構(gòu)和位置的特殊性，在外傷、手術(shù)、炎癥或腫瘤等情況下較易受到損傷，可引起部分或完全性面癱，嚴(yán)重影響面部美觀、功能及生活質(zhì)量[1]。面神經(jīng)損傷的藥物及手術(shù)治療效果欠佳，神經(jīng)功能恢復(fù)難以達(dá)到損傷前的水平，因此尋找有效的治療方法尤為重要。沃頓膠富含具有多向分化及神經(jīng)修復(fù)潛能的細(xì)胞，具有改善損傷局部微環(huán)境和神經(jīng)修復(fù)的作用[2]。本研究采用人臍帶沃頓膠薄片治療面神經(jīng)損傷模型大鼠，觀察髓鞘修復(fù)效果及電生理變化，測(cè)定損傷局部髓鞘蛋白及細(xì)胞因子的表達(dá)分布，探討可能的分子機(jī)制，為人臍帶沃頓膠薄片修復(fù)面神經(jīng)損傷奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器選用健康成年雌性Wistar大鼠64只，體重180～210 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002]。飼養(yǎng)條件符合清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，環(huán)境溫度控制在22～24 ℃。HE染色試劑盒購(gòu)于北京博奧森公司，髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP)、 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)及神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)購(gòu)于武漢博士德公司，ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)TSZ Biosciences公司。肌電圖誘發(fā)電位記錄儀[Keypoint 4(33A04)，Denmark公司]，電鏡(SMZ1000，尼康公司)。

1.2沃頓膠薄片制作人臍帶由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科提供,捐贈(zèng)者均簽署知情同意書，經(jīng)檢測(cè)傳染性相關(guān)指標(biāo)均呈陰性后用于本實(shí)驗(yàn)。剝離臍帶外膜并分離去除動(dòng)靜脈后即為沃頓膠組織，剪成 5 mm3大小組織塊，置于培養(yǎng)皿中，加入5 mL無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)在顯微鏡下觀察到培養(yǎng)皿中組織塊有間充質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)出時(shí)，說明沃頓膠組織已有活性。取出沃頓膠組織塊，采用細(xì)胞切片機(jī)將組織塊制成5 mm2大小，厚度50 μm的薄片備用。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及模型制作實(shí)驗(yàn)前仔細(xì)觀察大鼠面部，評(píng)估面神經(jīng)功能，確認(rèn)觸須活動(dòng)無異常、面部對(duì)稱、瞬目反射無異常。采用隨機(jī)數(shù)字表法將64只大鼠分為3組，假手術(shù)組(n=14)，模型組(n=25)，沃頓膠薄片組(n=25)。所有大鼠用鹽酸氯胺酮(0.2 mL/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉并維持體溫，固定頭顱，耳前后常規(guī)剃毛備皮消毒，于大鼠耳后橫行切口，逐層切開皮膚，暴露顳肌表面面神經(jīng)，沿面神經(jīng)分支逐步尋至面神經(jīng)莖乳孔出口，剝離莖乳孔后方附著于顱骨上的顳肌，暴露莖乳孔后方顱骨，以磨鉆緩慢仔細(xì)磨開顱骨，直徑約 5 mm，暴露面神經(jīng)顱內(nèi)段主干。假手術(shù)組只暴露面神經(jīng)主干，模型組以無損傷血管鉗鉗夾20 s，沃頓膠薄片組先鉗夾20 s，再將沃頓膠組織塊貼敷于損傷的神經(jīng)處，依次縫合肌肉和皮膚。模型制作中無大鼠死亡。

1.4大鼠面神經(jīng)功能評(píng)估分別在造模后第 1、3、10、20、30天測(cè)試瞬目反射、觸須活動(dòng)，觀察鼻尖位置，并進(jìn)行評(píng)分。①瞬目反射中雙側(cè)眼瞼閉合無明顯差異為0分，患側(cè)眼瞼閉合反應(yīng)較對(duì)側(cè)延遲為1分，患側(cè)眼瞼無法閉合為2分。②雙側(cè)觸須活動(dòng)靈敏、對(duì)稱、無明顯差異為0分，患側(cè)觸須活動(dòng)較對(duì)側(cè)明顯減弱但仍有觸須活動(dòng)為1分，患側(cè)觸須活動(dòng)完全消失為2分。③鼻尖位置居中為0分，鼻尖歪斜、偏向?qū)?cè)為1 分[3]。

1.5電生理檢查造模后第30天，采用肌電圖誘發(fā)電位記錄儀，在電磁屏蔽室內(nèi)進(jìn)行電生理檢測(cè)(雙側(cè)同時(shí)檢測(cè))。大鼠腹腔內(nèi)注射鹽酸氯胺酮(0.2 mL/kg)麻醉，取俯臥位，固定頭部及四肢。刺激電極和記錄電極均采用同心圓針型雙極電極。刺激電極置入面神經(jīng)出莖乳孔處皮下，記錄電極置于記錄側(cè)觸須墊肌肉中，接地電極置于鼠尾。采用波寬為0.2 ms，頻率為1 Hz的方波脈沖電流，連續(xù)同強(qiáng)度刺激誘發(fā)復(fù)合肌肉動(dòng)作電位，測(cè)量并記錄M 波潛伏期和波幅。每只大鼠測(cè)試2次，間隔10 min，取2次測(cè)試的平均值。測(cè)試完成后處死大鼠，取鉗夾損傷段面神經(jīng)主干，用于以下檢測(cè)。

1.6面神經(jīng)組織病理學(xué)觀察取面神經(jīng)主干，置于體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液中固定3 d，作冠狀位石蠟切片，片厚4 μm，HE染色，常規(guī)脫水，中性樹膠封片。光鏡(×200)下觀察。

1.7透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)取面神經(jīng)主干，PBS沖洗后，切成小組織塊，迅速加入體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛固定液，4 ℃避光保存。48 h后加體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸1.5 h，PBS洗3遍，梯度丙酮脫水，吸干液體，樹脂包埋。37 ℃烤箱過夜，切片、染色，透射電鏡(×4 200)下觀察。

1.8Western blot法測(cè)定面神經(jīng)MBP、BDNF、 NGF蛋白的表達(dá)取面神經(jīng)主干，加液氮研磨，加裂解液，在冰上裂解1 h，低溫離心15 min，吸取上清用BCA法進(jìn)行蛋白定量。灌制分離膠、積層膠。上樣電泳，恒壓80 V、40 min，切下目的蛋白和內(nèi)參，半干轉(zhuǎn)膜，恒流95 mA，60 min，將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜。脫脂奶粉封閉1 h。加一抗孵育，稀釋濃度比例：MBP(1∶50)，BDNF(1∶100)，NGF(1∶100)和β-actin(1∶200)。用TBST洗脫3次，每次5 min。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育2 h，TBST 洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影成像，用Im-age J 圖像分析軟件進(jìn)行條帶灰度分析。以目的蛋白和內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9ELISA檢測(cè)面神經(jīng)炎癥因子的分泌取面神經(jīng)主干，用液氮研磨，加裂解液，在冰上裂解1 h，低溫離心15 min，收集上清凍存。按照試劑盒說明測(cè)定IL-1β、 IL-10、TNF-α、NF-κB含量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)。采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析比較3組大鼠造模后不同時(shí)間點(diǎn)面神經(jīng)功能評(píng)分的差異，采用單因素方差分析比較3組大鼠其他指標(biāo)的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1術(shù)后一般情況及面神經(jīng)功能評(píng)分3組大鼠實(shí)驗(yàn)及觀察期間存活良好，切口無感染，無并發(fā)癥出現(xiàn)。假手術(shù)組大鼠瞬目反射靈敏，未出現(xiàn)觸須運(yùn)動(dòng)減弱，鼻尖位置居中。造模后第1、3、10、20、30天，模型組面神經(jīng)功能評(píng)分均較假手術(shù)組升高，第20、30天，沃頓膠薄片組面神經(jīng)功能評(píng)分較模型組降低，見表1。

表1 造模后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠面神經(jīng)功能評(píng)分

F組間=12.810，P<0.001；F時(shí)間=19.370，P<0.001；F交互=1.869，P=0.280；*：與假手術(shù)組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

2.2神經(jīng)電生理測(cè)定結(jié)果術(shù)后第30天，模型組M波潛伏期升高，神經(jīng)電位波幅降低，沃頓膠薄片組均較模型組改善，見表2。

表2 造模后第30天各組大鼠面神經(jīng)電生理檢測(cè)結(jié)果

*：與假手術(shù)組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

2.3損傷段面神經(jīng)病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)改變損傷段面神經(jīng)病理學(xué)改變：假手術(shù)組面神經(jīng)主干纖維呈長(zhǎng)條形，平行排列，細(xì)胞排列整齊，神經(jīng)纖維束被束膜包裹，結(jié)構(gòu)完整。模型組可見神經(jīng)纖維連續(xù)性中斷，大量炎性細(xì)胞增生，軸突連續(xù)性消失，施萬細(xì)胞腫脹，分布散亂，出現(xiàn)脫髓鞘改變。沃頓膠薄片組神經(jīng)損傷明顯減輕，可見再生的髓鞘，細(xì)胞分布欠均勻，再生毛細(xì)血管及膠質(zhì)細(xì)胞增多，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。超微結(jié)構(gòu)改變：假手術(shù)組神經(jīng)纖維髓鞘結(jié)構(gòu)完整、板層結(jié)構(gòu)清晰，無變性脫髓鞘情況，細(xì)胞器豐富。模型組電鏡下可見神經(jīng)纖維腫脹，呈現(xiàn)脫髓鞘改變，髓鞘結(jié)構(gòu)松散，呈空泡狀改變，并有沃勒變性后脫落的髓鞘。沃頓膠薄片組表現(xiàn)為髓鞘明顯增厚,但厚薄仍不均，髓鞘板層結(jié)構(gòu)略松散，有少量空泡狀改變。見圖1。

A:病理學(xué)改變；B：超微結(jié)構(gòu)；1～3：分別為假手術(shù)組、模型組、沃頓膠薄片組

2.4損傷段面神經(jīng)主干MBP、BDNF及NGF蛋白的表達(dá)與假手術(shù)組相比，模型組損傷段面神經(jīng)主干MBP、BDNF的表達(dá)減少，NGF的表達(dá)增多；與模型組相比，沃頓膠薄片組MBP、BDNF及NGF的表達(dá)增多，見圖2、表3。

2.5損傷段面神經(jīng)炎癥因子分泌水平的比較模型組損傷段面神經(jīng)IL-1β、IL-10、TNF-α、NF-κB的分泌高于假手術(shù)組，而沃頓膠薄片組IL-1β、IL-10、NF-κB的分泌降低，見表4。

1～3：分別為假手術(shù)組、模型組、沃頓膠薄片組

表3 3組大鼠損傷段面神經(jīng)主干MBP、BDNF及NGF蛋白表達(dá)的比較

*：與假手術(shù)組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

表4 3組大鼠損傷段面神經(jīng)炎癥因子水平的比較 mg/L

*：與假手術(shù)組相比，P<0.05；#：與模型組相比，P<0.05

3 討論

面神經(jīng)損傷后常表現(xiàn)為周圍性面癱，如額紋消失、鼻唇溝變淺、口角歪斜、鼓腮漏氣等[4-5]，給患者帶了諸多不便。目前臨床上的治療方法主要有藥物治療、物理治療等[6]，但面神經(jīng)損傷后的修復(fù)仍然是個(gè)棘手的問題。人臍帶沃頓膠是指臍帶去除外膜、動(dòng)靜脈后剩余的膠凍樣組織，其中富含大量的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有分化能力強(qiáng)、免疫源性低等特點(diǎn)[7]，有實(shí)驗(yàn)[8-9]證實(shí)其具有神經(jīng)修復(fù)作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通過面神經(jīng)擠壓建立面神經(jīng)損傷模型后模型大鼠面神經(jīng)功能評(píng)分較假手術(shù)組升高，說明造模成功。面神經(jīng)功能評(píng)估、神經(jīng)電生理檢測(cè)及組織病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察顯示面神經(jīng)損傷后發(fā)生脫髓鞘、髓鞘形成障礙及髓鞘形成延遲等病理改變。髓鞘結(jié)構(gòu)由施萬細(xì)胞、軸突和基膜相互作用而形成，整個(gè)發(fā)育過程受到嚴(yán)格調(diào)控，任何環(huán)節(jié)的異常均可能導(dǎo)致髓鞘形成障礙或髓鞘結(jié)構(gòu)異常，可導(dǎo)致相應(yīng)的周圍神經(jīng)病變。髓鞘還能為長(zhǎng)距離神經(jīng)沖動(dòng)跳躍式傳導(dǎo)提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，對(duì)神經(jīng)有營(yíng)養(yǎng)支持作用，可發(fā)揮促進(jìn)損傷修復(fù)等作用[10]。本研究結(jié)果顯示，沃頓膠能夠改善面神經(jīng)功能，促進(jìn)髓鞘完整性的恢復(fù)。

MBP是髓鞘的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達(dá)，分別由少突膠質(zhì)細(xì)胞和施萬細(xì)胞合成和分泌，占周圍髓鞘相關(guān)蛋白總量的15%～20%[11]。MBP對(duì)髓鞘保持緊密性具有重要的作用，可維持髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，同時(shí)對(duì)于髓鞘形成具有啟動(dòng)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)顯示沃頓膠能夠促進(jìn)MBP的表達(dá)，對(duì)髓鞘起到修復(fù)作用。沃頓膠纖維結(jié)構(gòu)之間有空隙存在，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給和代謝廢物的排泄，有助于細(xì)胞增殖和細(xì)胞分泌外基質(zhì)，此外其亦可分化為骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等[13-14]。我們推測(cè)沃頓膠這種結(jié)構(gòu)可為髓鞘細(xì)胞提供細(xì)胞支架材料，有利于髓鞘的修復(fù)。此外，薄片修復(fù)可避免局部大的瘢痕及細(xì)胞分布不均。

沃頓膠通過對(duì)局部微環(huán)境的影響促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，是因?yàn)樗蔀檫@種生物修復(fù)過程提供各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子[15]。研究[16]表明沃頓膠能夠促進(jìn)NGF的分泌，抑制炎癥介質(zhì)的釋放。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沃頓膠薄片組BDNF、NGF的表達(dá)高于模型組，而IL-10、IL-1β、NF-κB的分泌低于模型組，提示沃頓膠治療能夠增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、NGF的分泌，促進(jìn)神經(jīng)元的再生和分化，同時(shí)減輕面神經(jīng)損傷后的炎癥反應(yīng)，從而參與神經(jīng)損傷的修復(fù)。

總之，沃頓膠薄片可促進(jìn)大鼠面神經(jīng)損傷后的髓鞘修復(fù)，改善大鼠面神經(jīng)損傷后行為學(xué)及電生理情況，其機(jī)制可能與沃頓膠薄片上MBP的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、NGF的分泌，減少炎癥因子IL-1β、IL-10、NF-κB的釋放，改善損傷區(qū)域局部微環(huán)境有關(guān)。