鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ在維拉帕米逆轉肺腺癌順鉑化療耐藥中的作用

劉 淼, 范平生, 張騰躍, 黃 金, 樊高飛, 劉亞貝

(安徽省腫瘤醫院, 中國科學技術大學附屬第一醫院,中國科學技術大學 生命科學與醫學部, 安徽 合肥, 230000)

目前，早期肺癌仍缺乏有效的診斷手段，大多數肺癌患者初診時已為中、晚期，錯過了根治性治療的機會[1]。采用靶向治療、化學治療、放射治療、免疫治療等手段能使肺癌患者獲益，但仍有許多無靶向治療指征的肺癌患者因腫瘤耐藥性的產生而對化療不敏感，最終導致肺癌治療失敗。多年來，本課題組通過改善維拉帕米給藥途徑而顯著提高了晚期肺癌在內的多種實體腫瘤的治療療效，但具體機制尚不完全明確[2-4]。本課題組發現在肺腺癌細胞中，維拉帕米可以有效逆轉順鉑耐藥，并發現鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)參與維拉帕米逆轉肺腺癌細胞耐藥的過程，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

肺腺癌細胞株A549購自中國科學院細胞庫; 胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、DMEM培養基購自GIBCO公司; CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒購自碧云天生物技術公司, CaMKⅡ及P-CaMKⅡ抗體購自Abcam公司; HRP二抗和β-actin抗體購自Sigma公司，順鉑(DDP, 江蘇豪森, 30 mg/支)及維拉帕米(verapamil, 上海禾豐制藥, 5 mg, 2 mL)購自安徽省腫瘤醫院。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養: 肺腺癌細胞A549培養于含10%胎牛血清的DMEM完全培養基(含青霉素G鈉和鏈霉素各100 U/mL), 37 ℃、5% CO2培養箱中培養。用0.25%胰蛋白酶消化細胞，進行傳代或接種于孔板培養。

1.2.2 Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測細胞增殖: 取對數生長的A549接種到96孔板，約1×104細胞/孔，細胞貼壁后進行藥物處理。實驗分為正常組、維拉帕米組、順鉑單藥組(DDP)、順鉑聯合維拉帕米組(DDP+VER)。維拉帕米藥物濃度4.91 μg/mL, 順鉑濃度1.00 μg/mL。每組設置3個復孔，并設陰性對照，藥物作用48 h后加入CCK-8試劑(10.00 μL/孔)，作用1 h后用酶標儀進行檢測(Bio-Rad680)。藥物對細胞的抑制率(IR)=(OD空白-OD實驗)/OD空白×100%, OD為吸光度值。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡: 取對數生長的A549細胞接種于6孔板，藥物分組及濃度同1.2.2內容。藥物作用48 h后收集各組細胞重懸于500.00 μL的Binding Buffer中，依次加入Annexin V-FITC 5.00 μL和 PI 5.00 μL, 室溫避光孵育，流式細胞儀上機檢測(參照碧云天生物公司Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒說明書)。

1.2.4 Western blotting檢測蛋白表達水平: 藥物分組及濃度同1.2.2內容。將培養板內培養基棄去，冰PBS清洗后再次棄去，加入細胞裂解液于冰上裂解，充分刮離細胞并移入EP管內，置于100 ℃金屬浴鍋內10 min, 以標準血清蛋白為標準品測定蛋白濃度。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，半干轉至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜), 5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h, 加入一抗(稀釋比例: β-actin為1∶4 000; CaMKⅡ及P-CaMKⅡ為1∶1 000), 4 ℃孵育過夜, PBST洗滌后加二抗(1∶1 000)溫育2 h, 加 ECL于化學發光成像系統(ChemiScope 3600 Mini)進行成像。

1.3 統計學處理

應用SPSS 19.0進行數據的統計學分析，計量資料采用均數±標準差表示，比較采用獨立樣本t檢驗;P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 維拉帕米逆轉肺腺癌細胞順鉑化療耐藥的效果

A549細胞系在單藥阿霉素組、阿霉素聯合維拉帕米組中的抑制率分別為(55.00±2.60)%和(32.30±1.80)%, 差異有統計學意義(P<0.05)。2組與對照組相比均有顯著差異(P<0.05)。見圖1。

NC為正常組, VER為維拉帕米組, DDP為順鉑單藥組, DDP+VER為順鉑聯合維拉帕米組。與DDP+VER比較, *P<0.05。圖1 維拉帕米逆轉肺腺癌細胞順鉑化療耐藥的效果

2.2 維拉帕米促進肺腺癌細胞順鉑化療凋亡

在A549細胞中，單藥順鉑的凋亡率為10.30%, 順鉑聯合維拉帕米為21.60%, 差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

DDP組

DDP+VER組

圖2 維拉帕米促進肺腺癌細胞順鉑化療凋亡

2.3 Western blotting檢測蛋白表達水平

在A549細胞中，順鉑聯合維拉帕米組中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ的表達明顯低于單藥順鉑組。鑒于CaMKⅡ已被證實參與眾多腫瘤相關的信號傳導通路，作者測定了單藥化療組及聯合組中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ蛋白活性水平，結果證實聯合藥物組中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ蛋白表達低于化療單藥組。見圖3。

NC為正常組, VER為維拉帕米組, DDP為順鉑單藥組, DDP+VER為順鉑聯合維拉帕米組。圖3 各組P-CaMKⅡ、CaMKⅡ、β-actin的表達

3 討 論

姑息化療是治療晚期非小細胞肺癌患者的有效方法。與單純支持治療相比，使用含鉑類的聯合化療可有效提高生存率，改善生活質量。由于肺癌細胞對化療藥物的天然或繼發的耐受性，使得相當部分患者發生嚴重的不良反應，且未取得實質的治療效果。目前認為與腫瘤耐藥相關的機制主要包括ABC轉運蛋白的跨膜轉運、細胞解毒能力的增強、DNA損傷修復系統失調及凋亡相關通路受阻等[5]。

維拉帕米可以逆轉多種腫瘤細胞對化學藥物的耐藥性。體外研究[6]發現，維拉帕米有效逆轉腫瘤耐藥的濃度是6.00～10.00 μmol/L, 但維拉帕米的靜脈安全濃度是1.00～2.00 μmoL/L, 超過安全濃度會導致竇性心動過緩、房室傳導阻滯等嚴重的毒副作用。維拉帕米作為鈣離子阻滯劑，其靜脈應用時有誘發新的心臟疾病的風險。本課題組通過改變維拉帕米的給藥途徑(動脈介入化療、腹腔化療)并與化療藥物聯合應用，大大提高臨床療效，且未出現明顯的心臟惡性事件，但仍有部分患者療效欠佳[7-8], 這更加需要了解其逆轉耐藥的機制，尋找有效的預測分子。

CaMKⅡ是鈣信號下游的一種多功能絲/蘇氨酸蛋白激酶，存在4種不同基因亞型。Ca2+能與鈣調蛋白(CaM)結合，形成的鈣調蛋白復合物能夠促進鈣調蛋白與CaMKⅡ結合，從而使CaMKⅡ構象發生改變，引起酶的活化，調節不同細胞的生長。相關研究[9]表明α和β亞型在神經細胞的發育及功能活性中發揮重要作用，γ亞型在免疫系統尤其是T細胞記憶、CD8+細胞活化中發揮重要的作用[10], 而δ亞型的研究主要集中在調節心肌細胞的穩態和功能[11]。最近研究[12-13]表明, CaMKⅡ活化包括離子通道、激酶、轉錄因子在內的約40種蛋白質，從而在多種腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲、轉移中發揮重要的作用。CaMKⅡ各種亞型在非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、骨肉瘤等惡性腫瘤中過表達，且與其臨床病理參數密切相關[14-17]。研究[18-19]表明CaMKⅡ能夠通過調控腫瘤干細胞的生長及分化，進而在腫瘤復發、治療抵抗等方面發揮重要的作用。

本研究發現，在A549細胞中，維拉帕米能提高肺癌細胞中順鉑的抗癌能力，其抑制率及促進凋亡能力均顯著高于順鉑單藥組(P<0.05)。同時，維拉帕米聯合順鉑組中P-CaMKⅡ/CaMKⅡ低于順鉑單藥組，推測CaMKⅡ參與了維拉帕米逆轉化療耐藥的過程，但具體機制仍需進一步的探討。