絡石內生菌露濕漆斑菌發酵液的細胞毒活性成分研究

陳 曦, 張小君, 葉 桐, 張雨欣, 申 麗

(1. 揚州大學醫學院 轉化醫學研究院, 江蘇 揚州, 225001;2. 江蘇省中西醫結合老年病防治重點實驗室, 江蘇 揚州, 225001)

由于動植物資源的限制，從微生物(尤其是特殊生境微生物)資源中尋找藥物先導化合物已成為天然藥物研究的主流方向[1]。植物內生菌種類繁多而缺乏研究，在與宿主植物長期協同進化的過程中，能產生具有顯著生物活性和復雜結構的化合物。傳統藥用植物內生菌和特殊生境植物內生菌是植物內生菌來源天然藥物的兩個重要研究領域。絡石Trachelospermumjasminoides(Lindl. ) Lem. 是夾竹桃科絡石屬常綠木質藤本植物，其根、莖、葉、果實皆可供藥用。作為一種常用中藥，絡石具有祛風活絡、利關節、止血、止痛消腫、清熱解毒之效能，始載于《神農本草經》。前期實驗從絡石中分離得到一株內生真菌—露濕漆斑菌Myrotheciumroridum, 研究[2-5]表明，單端孢霉烯類化合物是M.roridum的特征次生代謝產物。單端孢霉烯類化合物具有豐富的結構多樣性和生物活性多樣性，尤其是顯著的體外和體內抗腫瘤活性[6-7]。本研究對該絡石內生菌發酵液的化學成分進行分析，以期獲得結構新穎、抗腫瘤活性顯著的單端孢霉烯類化合物，為抗腫瘤新藥的研究提供實驗依據。

以氫譜(1H-NMR譜)和薄層色譜(TLC)示蹤，采用硅膠柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析和高效液相色譜法(HPLC)進行發酵液化學成分的分離純化，結果分離獲得2個單端孢霉烯類化合物12′-hydroxyroridin E (1)和trichoverritone (2)。見圖1。體外細胞毒活性測定顯示，這兩個化合物對HepG2細胞和Hela細胞均有顯著的增殖抑制活性。進一步研究發現, 12′-hydroxyroridin E (1)能誘導HepG2細胞G2期細胞周期阻滯，并上調細胞中p27蛋白的表達，提示該化合物可能通過誘導細胞周期阻滯抑制HepG2細胞的增殖，該作用與細胞中p27蛋白表達上調相關。

12'-hydroxyroridin E (1)

trichoverritone (2)

圖1 單端孢霉烯化合物的結構

1 儀器與材料

1.1 主要儀器

AVANCE DRX-500核磁共振儀, 德國Bruker公司; AVANCE 600核磁共振儀，德國Bruker公司; UHR-TOF maXis超高分辨飛行時間質譜儀，德國Bruker公司; 高效液相色譜儀(L-7400檢測器, L-7100泵)，日本日立公司; P200Ⅱ高效液相色譜儀(UV200 Ⅱ檢測器, P200 Ⅱ型高壓恒流泵)，大連依利特公司; Series ⅡCO2細胞培養箱, Thermo公司; centrifuge 5415D離心機, Eppendorf公司; ELX800多功能酶標儀, Bio-Tek公司; FACSCalibur流式細胞儀, BD公司; JY-ZY5Western blot電泳儀, Bio-Rad公司。

1.2 藥品與試劑

柱層析硅膠(200～300目)，青島海洋化工廠分廠; Silica gel 60 F254鋁板(20 cm×20 cm), 瑞典Pharmacia Biotech公司; Sephadex LH-20, 瑞典Pharmacia Biotech公司; Apollo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 美國GRACE公司, Hypersil ODS2(200 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱，大連依利特分析儀器有限公司; 氘代氯仿，美國Aldrich公司; 氘代甲醇，青島騰龍微波科技有限公司; 氘代丙酮，美國Cambrideg Isotope Laboratories公司; 色譜甲醇，美國TEDIA化學試劑有限公司; RPMI 1640, 美國Gibco公司; 小牛血清，上海洛神公司; 胰蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司; MTT, 美國Amresco公司; 順鉑，江蘇豪森藥業股份有限公司; 碘化丙啶(PI), 上海江萊生物有限公司; 兔抗人p27抗體，美國Cell Signaling公司; 羊抗人β-actin單克隆抗體，美國Santa Cruz公司; 山羊抗兔IgG抗體，北京博士德公司; ECL化學發光試劑，北京普利萊公司; 其他試劑均為分析純。

1.3 細胞株

人肝癌細胞株HepG2和人宮頸癌細胞株Hela由本實驗室保存。

2 實驗方法

2.1 化合物的分離純化

絡石內生菌M.roridum采用液體發酵，發酵液經乙酸乙酯萃取3次，減壓去除溶劑，再經除鹽、除鈉得到粗浸膏12.2 g。采用硅膠柱層析進行粗浸膏粗分離，氯仿/甲醇梯度洗脫(100∶0→0∶100), 經TLC合并得到6個組分Fr. 1～Fr. 6。其中, Fr. 3經硅膠柱層析、CHCl3-MeOH梯度洗脫(100∶0→100∶16)得到Fr. 3.2, Fr. 3.2再經HPLC(甲醇-水 v/v 57∶43, 0.85 mL/min)純化得到化合物1(14.7 mg,tR=29.8 min)。Fr. 4經硅膠柱層析得到Fr. 4-2和Fr. 4-3, Fr. 4-3先經Sephadex LH-20凝膠柱層析，再經HPLC(甲醇-水 v/v 50∶50, 1 mL/min)純化得到化合物2(2.1 mg,tR=7.0 min)。

2.2 化合物的體外細胞毒活性測定

腫瘤細胞株在含10%新生牛血清的RPMI 1640培養液中，于37 ℃、5% CO2的CO2培養箱內培養至對數生長期。收集對數生長期的細胞，以1×104個細胞/孔接種于96孔板，常規貼壁培養12 h后，實驗組分別加入2 μL待測化合物[少量二甲基亞砜(DMSO)助溶, DMSO終濃度0.2%], 陰性對照組和空白組分別加入等體積DMSO和培養液。培養48 h后，每孔加入20 μL MTT, 繼續培育4 h。然后棄去培養液，每孔滴加150 μL DMSO, 37 ℃振蕩10 min, 使結晶充分溶解，酶標儀在波長490 nm處測定各孔吸光度值。

2.3 流式細胞術檢測細胞周期

取對數生長期腫瘤細胞接種在6孔板中，在37 ℃、5%CO2培養箱內培養12 h。然后每孔分別加入等量的化合物，干預24 h。收集細胞，用預冷的70%乙醇固定細胞, 4 ℃保存過夜，至少固定18 h。上機測試前, 2 400轉/min離心10 min除去乙醇，將細胞重懸于0.4 mL碘化丙錠染液中(其中含RNaseA), 37 ℃保溫30 min(碘化丙錠染液終濃度為50 μg/mL, RNaseA終濃度為20 μg/mL), 然后用400目網篩過濾。最后，進行流式細胞儀分析，應用ModFit LT3.0軟件分析細胞周期中各期細胞占總細胞的百分率。

2.4 Western blot法檢測蛋白表達水平

取加藥處理后的細胞，棄去培養液，以預冷的PBS洗滌2次，加入相應體積的1×SDS蛋白裂解液，冰上放置30 min。以刮棒刮下細胞，沸水浴10 min, 然后4 ℃, 12 000 轉/min離心30 min。取上清，用改良Lowry法進行蛋白定量。調整樣品蛋白質濃度使其相等，保證每個樣品孔蛋白的上樣量一致。蛋白質經SDS-PAGE后，轉移至PVDF膜上。PVDF膜以5%脫脂奶粉封閉4 h后，加入一抗過夜。經洗滌后，再加入辣根過氧化酶標記的二抗，室溫下反應3～4 h。每步反應結束均用PBST洗滌3次，每次10 min。最后用ECL化學發光，經曝光、顯影、定影后，膠片晾干保存，掃描后用Image J軟件進行圖像定量分析。

2.5 統計學分析

數據采用 SPSS 17.0進行單因素方差分析，組間差異用SNK法比較,P<0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 化合物的結構鑒定

化合物1: 無色油狀;1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ: 7.59 (1H, dd,J=15.4, 11.4 Hz, H-8′), 6.58 (1H, t,J=11.3 Hz, H-9′), 6.05 (1H, dd,J=7.8, 3.3 Hz, H-4), 5.89 (1H, br s, H-2′), 5.82 (1H, dd,J=15.5, 7.3 Hz, H-7′), 5.75 (1H, d,J=11.3 Hz, H-10′), 5.45 (1H, d,J=4.8 Hz, H-10), 4.80 (2H, d,J=9.1 Hz, H-12′), 3.86 (1H, m, H-11), 3.83 (1H, d,J=12.0 Hz, H-15a), 3.81 (1H, d,J=4.5 Hz, H-2), 3.73 (1H, m, H-5′b), 3.68 (1H, m, H-13′), 3.66 (1H, m, H-6′), 3.62 (1H, d,J=12.0 Hz, H-15b), 3.58 (1H, m, H-5′a), 3.10 (1H, d,J=3.9 Hz, H-13a), 2.78 (1H, d,J=3.9 Hz, H-13b), 2.69 (2H, m, H-4′), 2.48 (1H, br dd,J=15.5, 8.1Hz, H-3a), 2.04 (2H, m H-3b), 2.02 (1H, m, H-7b), 1.95 (2H, m, H-8), 1.69 (3H, s, H-16), 1.58 (1H, m, H-7a), 1.10 (3H, d,J=5.8 Hz, H-14′), 0.81 (3H, s, H-14);13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ: 174.8 (C-3′), 168.3 (C-1′), 167.3 (C-11′), 144.2 (C-9′), 141.4 (C-9), 139.7 (C-7′), 131.3 (C-8′), 119.6 (C-10′), 119.4 (C-10), 117.4 (C-2′), 86.1 (C-6′), 79.7 (C-2), 76.1 (C-4), 74.2 (C-12′), 70.5 (C-13′), 67.6 (C-11), 67.1 (C-5′), 66.4 (C-12), 63.3 (C-15), 49.6 (C-5), 48.8 (C-13), 45.0 (C-6), 36.9 (C-3), 30.0 (C-4′), 28.8 (C-8), 24.0 (C-16), 21.9 (C-7), 19.2 (C-14′), 7.36 (C-14);13C-NMR (CD3OD, 150 MHz) δ: 172.0 (C-3′), 167.5 (C-11′), 144.8 (C-9′), 141.9 (C-7′), 141.4 (C-9), 131.5 (C-8′), 119.8 (C-10), 119.4 (C-10′), 116.7 (C-2′), 86.3 (C-6′), 80.4 (C-2), 77.1 (C-4), 75.6 (C-12′), 70.5 (C-13′), 68.6 (C-11), 67.8 (C-5′), 66.9 (C-12), 62.4 (C-15), 50.2 (C-5), 48.8 (C-13), 45.7 (C-6), 37.8 (C-3), 30.2 (C-4′), 29.1 (C-8), 23.4 (C-16), 21.9 (C-7), 19.1 (C-14′). 7.7 (C-14); HR-ESI-MSm/z553.2403[M+Na]+, 分子式C29H38O9(C29H38O9Na理論值為553.2408)。以上數據與研究[8]報道基本一致，故鑒定化合物為12′-hydroxyroridin E。

化合物2: 白色固體;1H-NMR (aceton-d6, 500 MHz) δ: 7.62 (1H, dd,J=15.5, 9.5 Hz, H-8′), 6.76 (1H, t,J=11.5 Hz, H-9′), 6.05 (1H, dd,J=15.5, 7.4 Hz, H-7′), 5.93 (1H, br s, H-2′), 5.84 (1H, dd,J=7.8, 3.5 Hz, H-4), 5.75 (1H, s, H-2″), 5.67 (1H, d,J=11.4 Hz, H-10′), 5.40 (1H, d,J=4.4 Hz, H-10), 4.88 (2H, br s, H-12′), 4.27 (1H, d,J=12.4 Hz, H-15), 4.03 (1H, d,J=12.4 Hz, H-15), 3.79 (1H, m, H-11), 3.79 (1H, m, H-5′), 3.77 (1H, m, H-6′), 3.76 (1H, m, H, -2), 3.73 (1H, m, H-13′), 3.70 (2H, m, H-5″), 3.66 (1H, m, H-5′), 3.09 (1H, d,J=4.1 Hz, H-13), 2.89 (1H, d,J=4.1 Hz, H-13), 2.78 (2H, m, H-4′), 2.55 (1H, dd,J=15.2, 7.8 Hz, H-3), 2.36 (2H, t,J=6.3 Hz, H-4″), 2.16 (3H, d,J=1.0 Hz, H-6″), 1.96 (1H, m, H-3), 1.96 (1H, m, H-8), 1.96 (1H, m, H-8), 1.93 (1H, m, H-7), 1.85 (1H, m, H-7), 1.68 (3H, s, H-16), 1.06 (3H, d,J=6.0 Hz, H-14′), 0.82 (3H, s, H-14);13C-NMR (aceton-d6, 125 MHz) δ: 174.5 (C-1′), 170.0 (C-3′), 166.5 (C-1″), 166.3 (C-11′), 158.9 (C-3″), 144.6 (C-9′), 141.5 (C-7′), 140.3 (C-9), 130.8 (C-8′), 119.9 (C-10), 118.8 (C-10′), 117.3 (C-2″), 116.5 (C-2′), 86.0 (C-6′), 79.5 (C-2), 76.1 (C-4), 74.2 (C-12′), 69.7 (C-13′), 67.5 (C-5′), 67.2 (C-11), 66.1 (C-12), 63.3 (C-15), 60.4 (C-5″), 49.7 (C-5), 48.1 (C-13), 44.6 (C-4″), 44.2 (C-6), 37.4 (C-3), 29.6 (C-4′), 28.6 (C-8), 23.2 (C-16), 21.7 (C-7), 19.1 (C-14′), 18.9 (C-6″), 7.5 (C-14); HR-ESI-MSm/z665.2895[M+Na]+, 分子式C35H46O11(C35H46NaO11理論值為665.2932)。以上數據與研究[5]報道基本一致, 故鑒定化合物為trichoverritone。

3.2 化合物的體外細胞毒活性

采用MTT法對化合物進行體外細胞毒活性測定，測試細胞株為人肝癌細胞株HepG2和人宮頸癌細胞株Hela, 順鉑為陽性對照。結果發現, 12′-hydroxyroridin E (1)和trichoverritone (2)對HepG2細胞和HeLa細胞均有明顯的增殖抑制作用，其IC50值分別為0.78和1.86 μg/mL、0.05和0.13 μg/mL, 陽性對照順鉑的IC50值分別為4.9和2.28 μg/mL。

3.3 化合物1對HepG2細胞的細胞周期影響

細胞增殖受到細胞周期的精密調控，因此，細胞周期的失調是腫瘤發生的內在因素。為探討12′-hydroxyroridin E (1)的增殖抑制作用是否與誘導細胞周期阻滯相關，本研究采用一定濃度(0.01、0.1、1、2和10 μg/mL)的化合物1處理HepG2細胞24 h, 然后收集細胞，經乙醇固定、PI染色后，進行細胞周期分析。結果發現, 12′-hydroxyroridin E處理后的HepG2細胞，其G2期細胞比例增加, G1期細胞比例略有上升, S期細胞比例明顯下降。見圖2。該結果提示, 12′-hydroxyroridin E可能誘導HepG2細胞G2期周期阻滯，進而抑制其細胞增殖。

圖2 化合物1對HepG2細胞的細胞周期影響

3.4 化合物1對HepG2細胞中的細胞周期

負調控蛋白p27表達的影響

p27是一種重要的細胞周期負調控蛋白[9], 為探討12′-hydroxyroridin E誘導HepG2細胞周期阻滯的作用是否與p27蛋白相關，本研究采用一定濃度(0.01、0.1、1、2和10 μg/mL)的12′-hydroxyroridin E處理HepG2細胞24 h, 收集細胞蛋白，采用Western blot分析p27蛋白的表達，以未加藥孔蛋白作陰性對照(NC), actin為內參。Western blot分析發現, 12′-hydroxyroridin E處理后的HepG2細胞中p27蛋白表達量上升(見圖3), 提示該化合物可能通過上調p27蛋白的表達而誘導HepG2細胞G2期阻滯。

與陰性對照NC相比, *P<0.05, **P<0.01圖3 化合物1對HepG2細胞p27蛋白表達的影響

4 討 論

由于人口增長和社會老齡化，癌癥的發病率和致死率仍呈上升趨勢，嚴重威脅著人類的健康與生命。據資料[10]統計, 2018年全球癌癥新增病例1 810萬，死亡病例960萬; 75歲前患癌癥的風險約為20%, 病死率為10%。目前癌癥治療主要采用手術、放療和化療等綜合措施，其中化學藥物治療存在藥物價格貴、治療效果差、復發轉移率高且腫瘤治療副作用大、精準性差等問題，因此，臨床迫切需要高效、低毒的新型藥物。天然產物在新藥及新藥先導化合物的發現中起著不可替代的作用。Butler等[11]調查發現, 2008—2013年共有25個天然產物和天然產物衍生藥物被批準上市; 2008—2013年處于臨床試驗的100個天然產物相關藥物中, 50個藥物是直接天然產物或天然產物的半合成衍生物，其中38個藥物是抗腫瘤藥物。盡管合成化學與現代組合化學及高通量藥物篩選技術交叉結合加快了抗腫瘤新藥的研制，但目前從天然資源中尋找抗腫瘤活性物質仍然是發現新藥的主要途徑。本研究對絡石內生菌M.roridum發酵液的化學成分進行研究，結果分離獲得2個具有顯著體外細胞毒活性的單端孢霉烯化合物12′-hydroxyroridin E (1)和trichoverritone (2), 為后續研究提供了化合物來源。

細胞周期主要由細胞周期蛋白、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDKI)共同調節。CDKI可分為兩類，即特異性抑制cyclin D-CDK4/CDK6活性的細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑4(INK4)(包括p15、p16、p18和p19)和廣譜的細胞周期蛋白依賴性激酶相互作用蛋白(CIP)/激酶相互作用蛋白(KIP)(包括p21、p27和p57)[12]。作為非特異性CDKI, p27(也稱為KIP1)主要通過抑制G1期的細胞周期蛋白-CDK復合物(如細胞周期蛋白E-CDK2和細胞周期蛋白D-CDK2)對細胞周期進行負調控[13-14]。單端孢霉烯化合物mytoxin B和myrothecine A對SMMC-7721細胞的增殖抑制與p27介導的S期細胞周期阻滯相關[15]。本研究也發現, 12′-hydroxyroridin E (1)對HepG2細胞的增殖抑制作用與G2期細胞周期阻滯相關。這說明單端孢霉烯化合物對人肝癌細胞株的增殖抑制作用與其誘導細胞周期阻滯密切相關。

細胞增殖、細胞周期和細胞凋亡之間存在密切聯系。除細胞周期阻滯外，細胞凋亡(Ⅰ型程序性細胞死亡, PCD)也可引起細胞的增殖抑制[16-17]。靶向腫瘤相關的信號傳導途徑來抑制或逆轉腫瘤發生發展成為化學藥物治療的一種重要策略。PI3K/Akt信號通路是酪氨酸激酶受體介導的一條重要的細胞內信號轉導通路[18], 其通過影響下游效應分子的活性在細胞凋亡和增殖中起關鍵作用。研究[19-20]表明, PI3K/Akt信號通路可以通過多種機制抑制細胞凋亡。單端孢霉烯類化合物是否能夠靶向PI3K/Akt信號通路、誘導細胞凋亡發揮其體外抗腫瘤作用，值得進一步深入研究。