大豆異黃酮與腸道微生物相互作用研究進展

梁文歐，趙力超，方 祥，王 麗*

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

大豆異黃酮是大豆或苜蓿等植物產生的黃酮類次級代謝產物，在大豆及其制品豆漿、豆腐、豆芽等食物中廣泛存在[1-2]。膳食攝入大豆異黃酮與人體健康有密切的關系[3]。世界衛生組織對全世界25 個國家的61 個群體進行的“心血管疾病和食物關聯比較研究（CARDOIAC）1985ü2005”發現，尿液代謝物中異黃酮含量大于20 μmol/d的人群與異黃酮含量小于1 μmol/d的人群相比，前者患與冠狀動脈疾病、前列腺癌以及乳腺癌有關疾病的死亡率更低[4]。其次，大豆異黃酮作為一種典型的植物雌激素，具有弱雌激素活性，在不同個體雌激素水平下可發揮類雌激素或抗雌激素雙向調節功能，并在荷爾蒙依賴相關的代謝中發揮重要作用，亦有抗氧化、抗腫瘤、抗成骨細胞凋亡作用等功能[5-7]。盡管大豆異黃酮對人體健康有益，但是其有效組分主要是以結合態的糖苷形式存在，生物可利用度（小于5%）極低，制約了大豆異黃酮的充分利用。研究發現，大豆異黃酮糖苷組分與結腸菌群相互作用可產生生物活性和生物可利用度顯著提高的新型微生物轉化物，促進大豆異黃酮生理活性的充分發揮[8]。因此，本文將對大豆異黃酮與復雜的腸道菌群系統相互作用進行綜述，以期為功能食品組分與腸道菌群互作影響健康作用的研究提供參考。

1 腸道菌群生物轉化提高了大豆異黃酮的生物活性和生物可利用度

目前對膳食中的大豆異黃酮被攝入體內后如何被代謝、代謝后生成哪些代謝產物以及代謝產物活性如何了解較少。事實上，大豆異黃酮中只有結構簡單的苷元能被小腸直接吸收，其組分只占大豆異黃酮的5%～10%，剩下90%以上異黃酮組分是以糖苷形式存在[9]。結合態糖苷多以共價作用與細胞壁結構成分結合，如羥基苯甲酸通過苯環上的羥基與木質素連接成鍵，或者通過羧基與糖類和蛋白形成酯。結合態糖苷能夠抵抗胃和小腸的消化作用到達結腸，繼而被腸道微生物代謝[10]。腸道微生物對大豆異黃酮的影響主要包括兩個方面：1）食物中的大豆異黃酮結合態糖苷在腸道微生物的作用下能夠游離出來；2）結腸中大豆異黃酮能在腸道微生物分泌的酶作用下進行代謝。如圖1所示，結合型糖苷首先在小腸中進行去糖基化，依靠β-葡萄糖苷酶去除糖苷鍵得到游離苷元，此后會有兩種代謝途徑，第一條途徑是游離苷元進入結腸，由結腸菌代謝游離苷元，最后通過糞便排出；第二條途徑是游離苷元經腸內循環和腸肝循環，最終以尿液的形式排出代謝物；或者產物在小腸處重新解聚成游離苷元進入結腸，最終以糞便形式排出。從大豆異黃酮在體內的代謝途徑分析，腸道微生物對大豆異黃酮的生物轉化主要集中在將結合態糖苷游離出來和結腸菌群代謝作用。

圖1 大豆異黃酮代謝示意圖[11]Fig.1 Schematic representation of soy isof l avone metabolism[11]

1.1 腸道微生物對大豆異黃酮結合態糖苷的游離作用

大豆異黃酮按形態分為游離型苷元和結合型糖苷兩類，數量有12 種[12]。游離型苷元主要包括黃豆苷元、染料木黃酮和大豆黃素；結合型糖苷由3 種游離苷元分別與葡萄糖、丙二酰基葡萄糖、乙酰基葡萄糖以β-糖苷鍵連接而成[11]，結合型糖苷是人們日常食用的大豆及其制品中大豆異黃酮的主要存在形式。

腸道微生物對結合型苷元的釋放主要借助于其所分泌的酶作用而實現。腸道菌群為大豆異黃酮生物轉化過程提供宿主不具備的酶。β-葡萄糖苷酶是研究最多的一種水解酶，可將外源糖苷轉化為相應的苷元和葡萄糖。腸道中的擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）細菌，如腸球菌（Enterococcus）、乳酸桿菌（Lactobacillus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）、梭狀芽孢桿菌（Clostridium）等都含有編碼豐富的糖苷水解酶基因，可代謝多種糖苷成分[13]。β-葡萄糖苷酶水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基[14]，最終使結合型糖苷發生解離而釋放成為游離苷元。研究發現，β-葡萄糖苷酶對底物的糖基部分結構的專一性較差，水解CüO糖苷鍵、CüS鍵、CüN鍵等[15]，這給β-葡萄糖苷酶水解不同形式的大豆異黃酮提供可能。Day等[16]使用人類小腸和無肝細胞提取物證明L-葡萄糖苷酶能去除異黃酮上的糖基。另外，Hawksworth等[17]研究發現，直腸內的細菌，如Lactobacillus spp.、Bifidobacterium spp.等都擁有β-葡萄糖苷酶的活性，并且β-葡萄糖苷酶參與糖酵解途徑，是Bif i dobacterium參與糖代謝的有關酶系之一。

1.2 腸道微生物對大豆異黃酮的代謝降解

膳食中的結合型糖苷被腸道微生物游離后或直接進入結腸的游離苷元在腸道微生物作用下進一步被代謝降解。腸道微生物介導的大豆異黃酮代謝降解主要包括還原、開環、去酮基等反應（表1）。結合圖2的游離苷元經腸道微生物介導的代謝降解過程[18]，還原反應是游離苷元C環的2、3位間雙鍵加氫變成單鍵；開環反應是C環的1位打開，加上羥基或者甲基；去酮基反應是去除C環的4位酮基，且去酮基反應是生成雌馬酚或者雌馬酚衍生物的過程。從圖2中可看出，不同游離苷元由腸道微生物介導代謝形成的產物結構相似。黃豆苷元經腸道微生物作用代謝成去氧甲基安哥拉紫檀素（O-desmethylangolensin，O-Dma）或者雌馬酚；染料木黃酮經微生物作用代謝成對乙基苯酚或者5-OH-雌馬酚；大豆黃素的代謝結果為6,7,4-三羥基異黃酮。每一種游離苷元在代謝的最后都經歷開環或者去酮基作用，生成開環代謝產物或去酮基代謝產物。

表1 不同轉化功能的大豆異黃酮轉化菌株Table1 Soy isof l avone transformation by different functional strains

腸道微生物對游離苷元的代謝降解主要是借助于其分泌的一系列酶的作用而實現，不同階段所需的酶不同，因此對大豆異黃酮的作用方式不同。結合型糖苷的去糖基化過程需要乳酸桿菌（Lactobacillus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）等分泌的β-葡萄糖苷酶；而對游離苷元而言，需要黃豆苷元還原酶、二氫黃豆苷元酶、四氫黃豆苷元還原酶等酶系。在此基礎上，有學者研究調控這3 種酶的相關基因，如Schr?der等[19]用Slackia isoflavoniconvertens DSM 22006把黃豆苷元轉化為雌馬酚，通過二維差異凝膠電泳觀察幾種蛋白質的誘導情況。在確定的肽序列的基礎上，作者發現了一組編碼黃豆苷元誘導蛋白的8 個基因，在8 個基因中dzr、ddr和tdr經大腸桿菌和酶活性測試，確定其相應的編碼產物分別是黃豆苷元還原酶（daidzein reductase，DZNR）、二氫黃豆苷元還原酶（dihydrodaidzein reductase，DHDR）和四氫黃豆苷元還原酶（tetrahydrodaidzein reductase，THDR）。由dzr（AFV15453）編碼的DZNR氨基酸序列與Slackia sp. NATTS（BAL46928）顯示出95%的序列相似性，與Lactococcus sp. 20-92（BAJ72747）有42%的序列相似性。ddr（AFV15451）編碼產物屬于“經典”短鏈脫氫酶/還原酶，由ddr編碼DHDR的氨基酸序列與Slackia sp. NATTS（BAL46929）的有93%序列相似性，與Lactococcus sp. 20-92（BAJ72747）有86%的序列相似性。由tdr（AFV15450）編碼的THDR氨基酸序列與Slackia sp. NATTS（BAL46928）的有90%序列相似性，與Lactococcus sp. 20-92（BAJ72747）的有87%的序列相似性。類似地，Kawada等[20]發現Eggerthella sp.YY7918編碼的DZNR、DHDR和THDR的基因命名分別為eqlA、eqlB和eqlC，其編碼序列與Lactococcus sp. 20-92（BAJ72747）有99%的序列相似性。

圖2 不同游離苷元在結腸的代謝轉化[18]Fig.2 Metabolic transformation of different free aglycones in the colon[18]

影響腸道微生物對大豆異黃酮代謝的因素除了腸道微生物分泌酶的作用，還包括：1）腸道微生物的底物專一性。如Clostridium sp. TM-40（AB249652）只還原黃豆苷元[23]，不還原染料木黃酮和大豆黃素；而Eubacterium ramulus可以還原黃豆苷元和染料木黃酮[25]，這主要是由于3 種游離苷元的結構具有差異，而若同一種菌株所分泌酶的底物專一性強，有可能造成某些菌株不能同時代謝3 種游離苷元的情況；2）人體腸道微生物組成。研究表明人的雌馬酚代謝表型（即能否將黃豆苷元轉化為雌馬酚）決定于其腸道的微生物組成，雌馬酚產生者的腸道中有Streptococcus intermedius spp.、Ruminococcus productus spp.、Bacteroides ovatus spp.等微生物，而非雌馬酚產生者的腸道中則缺少這些細菌[32]。

2 大豆異黃酮對腸道微生物菌群結構及其酶活性的影響

大豆異黃酮對腸道微生物的影響主要包括兩個方面：1）大豆異黃酮對腸道微生物菌群構成的影響；2）大豆異黃酮對腸道微生物酶活性的影響。這是因為大豆異黃酮在腸道內作為菌群培養基，不僅能為腸道菌群提供營養物質，幫助腸道菌群在腸道中定植、成熟，還能保持腸微生態系統穩定；某些腸道菌群可生成有利于身體健康的代謝產物如短鏈脂肪酸、乳酸等，維持腸道菌群平衡；還能有助于抑制病原微生物生長[33]。而腸道菌群也會分泌相關促進大豆異黃酮代謝的酶系，因此大豆異黃酮對腸道微生物的酶活性產生一定影響。

2.1 大豆異黃酮對腸道微生物菌群構成的影響

大豆異黃酮在腸道菌的作用下代謝成雌馬酚等對人體有益的物質，代謝物的產生取決于特定腸道菌群結構及其發揮的生物轉化功能，而特定腸道菌群結構又受到大豆異黃酮調控影響。對17 名絕經后婦女的研究顯示，補充大豆異黃酮1 周后，腸道微生物群變化個體差異顯著[34]。在這項研究中，受試者被給予含有160 mg大豆異黃酮（包括染料木黃酮、大豆黃素和黃豆黃素）和1 g皂角苷的大豆條。結果發現，在腸道微生物群中Bifidobacteria比例顯著增加，Lactobacillus減少，而雌馬酚產生者的Bifidobacteria和Eubacteria的水平比非雌馬酚產生者的增加更明顯。另一項研究也報道了類似的結果，其中39 名絕經后婦女連續兩個月每天接受100 mg大豆異黃酮，觀察到Clostridium、Eubacterium、Lactobacillus、Enterococcus、Faecalibacterecterium以及Bif i dobacterium的數量增加，而12 名雌馬酚產生者體內的Clostridium和Eubacterium的數量比非雌馬酚產生者增加更明顯[35]。然而也有研究表明，16 名絕經期婦女每天服用一片含有80 mg大豆異黃酮濃縮物的片劑，發現大豆異黃酮對腸道菌群影響不顯著[36]。

2.2 大豆異黃酮對腸道微生物酶活性的影響

腸道微生物可產生與宿主能量代謝、物質代謝及遺傳信息轉運等系列生理過程密切相關而種類繁多的酶系統，主要包括水解酶、氧化還原酶、抗氧化酶等[37]。研究發現，大豆異黃酮對腸道微生物的酶系統有顯著影響，其影響途徑主要包括：大豆異黃酮通過改變腸道微生物的種類和數量，進而使微生物代謝酶的種類和數量發生相應改變，最終影響到酶參與的代謝反應。大豆異黃酮加快Lactobacillus spp.、Bifidobacterium spp.等分泌β-葡萄糖苷酶的速率[38]，進而促進結合型糖苷的水解。不僅如此，大豆異黃酮還促使Slackia isof l avoniconvertens DSM 22006、Eggerthella sp.YY7918等菌株分泌DZNR、DHDR、THDR，進而加快游離苷元的代謝轉化過程。大豆異黃酮除了在體內代謝過程中對腸道微生物酶活性產生影響，還增強抗氧化酶活性。Gunae等[39]的研究表明，大豆異黃酮可顯著升高大鼠血清中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的活力，減少丙二醛含量，誘導酶活性防御系統，消除老化代謝產物，發揮機體抗氧化機能。

3 大豆異黃酮及其腸道微生物代謝主產物S-雌馬酚對人體相關疾病的預防

大豆異黃酮及其腸道微生物代謝主產物S-雌馬酚被認為是潛在抗癌物質，對前列腺癌、乳腺癌等雌激素依賴性腫瘤有一定的治療與預防作用。同時，其作為一種良好的活性氧自由基清除劑，抗氧化作用顯著。另外，這兩類物質屬于弱的植物雌激素，能較弱地與雌激素受體結合并呈現雌激素樣活性，具有預防和治療骨質疏松癥、心血管疾病、動脈粥樣硬化等多種生物學活性。

3.1 抗腫瘤作用

大豆異黃酮及其腸道微生物代謝主產物S-雌馬酚的抗腫瘤活性研究主要集中于抗乳腺癌和前列腺癌，其通過抑制腫瘤細胞增殖、促進其凋亡而發揮抗癌作用。

在預防乳腺癌方面，Ye Dengfeng等[40]證明大豆異黃酮中的染料木黃酮誘導細胞凋亡和典型的G2/M細胞周期停滯。從機理上看，染料木黃酮通過抑制Skp2和促進其下游靶點腫瘤抑制基因p21和p27發揮其腫瘤抑制效應。S-雌馬酚（0.1～350 μmol/L）以時間和劑量依賴性方式抑制人乳腺癌細胞系MDA-MB-231和T47D細胞生長，雌馬酚被認為是放射增敏劑，能夠誘導癌細胞凋亡[41]。

在預防前列腺癌方面，染料木黃酮被廣泛研究用來抑制前列腺癌。Bilir等[42]證明染料木黃酮誘導調節幾種基因，包括NOTCH3、JAG1、ADCY4和NEU1，這些基因可能成為染料木黃酮治療前列腺癌的新型分子靶點，從而進一步了解前列腺腫瘤發生過程中涉及到的多分子途徑，研究染料木黃酮對這些基因在蛋白質水平和細胞功能的表達影響。S-雌馬酚具有顯著的抗前列腺癌活性，經S-雌馬酚治療后，LnCap、DU145和PC3 3 種前列腺癌細胞系以濃度依賴性方式表現出細胞凋亡率增加，這可能是S-雌馬酚通過Akt特異性途徑，進而激活FOXO3a和抑制MDM2表達，從而實現其抗癌作用[43]。

3.2 抗氧化作用

大豆異黃酮能夠清除人體內的活性氧自由基，保護人體內脂質、蛋白質、染色體免受活性氧的攻擊，減少脂質過氧化物的產生，因而可以防止細胞發生病變，延緩人體組織老化，產生抗機體衰老作用。大豆異黃酮抑制過氧化物生成，是有效的過氧化氫清除劑。Wei Huachen等[44]證明大豆異黃酮中的染料木黃酮可明顯抑制致癌劑12-O-十四?；鸩ù?13-乙酸酯誘導HL-60細胞產生過氧化氫。染料木黃酮的抗氧化能力與結構中4’和5位羥基以及芳香環的位置（C3和C2對稱）密切相關。其次，大豆異黃酮的抗氧化作用還表現在減少活性氧自由基對DNA的損傷。8-羥基-2’-脫氧鳥苷是DNA中鳥嘌呤被細胞有氧代謝過程中形成的某些活性氧攻擊而產生的一種修飾堿基，即DNA氧化應激損傷的標志分子，大豆異黃酮可以有效抑制8-羥基-2’-脫氧鳥苷的產生[5]，因此它能預防DNA的氧化損傷。

在已知的大豆異黃酮所有代謝產物中，S-雌馬酚被認為是生理活性最高的成分，其抗氧化活性要比親本化合物黃豆苷元高出100多倍[45]。S-雌馬酚屬于多酚類物質，可作為氫/電子受體，清除自由基。Rimbach等[46]研究發現S-雌馬酚在清除巨噬細胞產生的一氧化氮能力上和大豆苷元類似，僅次于染料木黃酮。

3.3 對其他疾病的影響

大豆異黃酮對其他常見疾病如心血管疾病、糖尿病、骨質疏松癥也有一定的預防和治療作用。大豆異黃酮對心血管的保護作用是由于大豆異黃酮可以修復內皮細胞損傷。王燕等[47]的研究表明，大豆異黃酮對過氧化氫和脂多糖所致的人臍靜脈內皮細胞氧化損傷具有明顯的保護作用，并能減少內皮細胞的凋亡，從而維持血管穩態、保持內皮的相對穩定和預防血栓形成。大豆異黃酮能夠直接影響細胞增殖及葡萄糖刺激的胰島素分泌[48]，改善葡萄糖代謝，調節人體內的激素和酶，進一步防治人體肥胖、糖尿病及其并發癥等疾病。大豆異黃酮預防骨質疏松癥是由于其具有雌激素作用。Jin Xin等[49]的研究結果表明黃豆苷元以雌激素受體依賴性方式激活絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調節激酶和磷酸肌醇3-激酶/Akt或磷脂酰肌醇3激酶-Akt/Akt，促進人類成骨細胞樣MG-63細胞中的增殖、分化和抗凋亡來刺激成骨。

腸道微生物代謝主產物S-雌馬酚在預防動脈粥樣硬化、防止骨質疏松等方面的作用普遍受到關注。Zhang Ting等[50]的研究結果表明動脈粥樣硬化的發展與內質網過度應激密切相關，S-雌馬酚上調內質網應激標記物的表達，包括p-PERK、p-eIF2α、GRP78、ATF6和CHOP蛋白；并且Nrf2 siRNA可干擾CHOP的誘導作用，S-雌馬酚可通過激活Nrf2信號通路來減輕內質網應激，從而改善動脈粥樣硬化。防止骨質疏松方面，S-雌馬酚改善骨礦物質密度，抑制白細胞介素-6及其受體的表達，激活雌激素受體β活性，降低破骨細胞相關基因的表達，從而預防骨質疏松癥[51]。

4 結 語

近年來，隨著腸道微生物在健康調控和代謝控制中的作用逐步得到確認，腸道微生物相關健康科學得到了飛速發展。就大豆異黃酮而言，腸道菌群的參與使我們對大豆異黃酮的體內代謝吸收有了新的認識，而利用膳食調節和優化腸道菌群進而提升人類的健康水平有著巨大的現實意義。雖然大豆異黃酮與腸道菌群的相互作用方面的研究得到了學者極大的重視，并且取得一些可喜的成果，然而，尚有一些問題值得進一步探索：首先，大豆異黃酮對人的有益調節作用主要在于攝入體內的大豆異黃酮在腸道微生物菌群的作用下如何被轉化，需要明確腸道菌群結構調整背景下有哪些細菌類群主導參與了大豆異黃酮生物轉化過程；其次，腸道微生物通過群落而非單一個體來發揮重要功能，微生物相互作用、共同協作，一起完成復雜的代謝功能，需要明確大豆異黃酮與腸道菌群的相互作用機理；最后，需要解決大豆異黃酮在腸道菌群作用下的代謝通路，明確關鍵因子的調控作用。

多組學技術迅速發展，為大豆異黃酮與腸道菌群的相互作用研究提供了極大便利[52]。宏基因組高通量測序技術結合生物信息工具分析，有助于查找大豆異黃酮在生物轉化過程中的關鍵細菌群，得到高通量、高分辨率和低誤差的檢測結果[53]。代謝組學技術有助于發現腸道菌群與代謝的密切關系，尋找潛在的共代謝標志物，鑒定與包括大豆制品在內的膳食代謝過程中的關鍵功能菌，從而了解大豆異黃酮多成分、多靶點、多層次的作用機制[54]。但是宏基因組學分析并不能區分表達基因與非表達基因，因此，轉錄組學及蛋白質組學的應用顯得尤為必要。最終，多組學的關聯分析將有助于進一步闡明大豆異黃酮發揮生理活性的作用物質基礎，以及腸道菌群介導的分子機制。最后，研究膳食組分與復雜的腸道菌群系統的相互作用，需要構建人源化的小鼠模型[55]，這樣可以克服以人為研究對象時無法精確控制食物成分的困難，降低非可控因素的影響，能夠相對客觀地反映膳食組分的代謝過程。將高通量宏基因組測序技術與宏轉錄組、代謝組技術相結合用于研究大豆異黃酮在結腸的生物轉化過程，并從整體水平對不同層次的研究成果加以整合，可獲得研究對象的整體性特征。