骨骼肌細胞氧化應激損傷與黃芪多糖的干預研究

鄧聰，楊志敏，徐福平，孫玉姣，陳玉狀，賴艷嫻，岑美婷

(1.廣州市第一人民醫院南沙醫院，廣東 廣州 511457；2.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510120)

人體質量的40%～50%由骨骼肌組成[1]，骨骼肌是人體內最大的器官系統。在人體衰老的進程中，骨骼肌是最早受到影響的組織之一[2]，并表現出與年齡相關的變化，如功能障礙和質量損失。大量證據表明，氧化應激(Oxidative stress，OS)導致了骨骼肌萎縮，增加的活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)促進了骨骼肌萎縮的發生，累積的ROS可促進蛋白質水解增加并抑制蛋白質合成[3]。因此，減少骨骼肌中ROS和抑制OS，對于預防和治療骨骼肌萎縮很關鍵。文獻報道，黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)有良好的抗氧化作用[4]。本實驗通過建立氧化應激骨骼肌細胞模型，觀察APS對其的影響，為今后的實驗提供依據。

1 材料和方法

1.1 細胞和試劑

細胞培養：C2C12骨骼肌細胞，購自中國科學院細胞庫，使用含10%新生胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的DMEM，在37℃、5% CO2、95%濕度培養箱培養。2～3 d/傳代，待進入生長對數期后進行分組實驗。

APS(美國泛華生物公司)；新生胎牛血清、青霉素和鏈霉素(四季青生物工程研究所)；DMEM培養基(Hyclone公司)；DCFH-DA、過氧化氫(H2O2)(Sigma公司)；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物有限公司)。

1.2 氧化應激骨骼肌細胞模型

將對數生長良好的骨骼肌細胞接種于96孔培養板(密度5×104/mL)，根據H2O2濃度分為4組：100 μM(100組)、200 μM(200組)、300 μM(300組)、400 μM(400組)及正常組，每組6個復孔，分別培養12 h、24 h。MTT法檢測(設調零組)，每孔加入50 μL MTT，37℃溫育4 h，吸棄上清液，加入200 μL DMSO，振蕩10 min，在酶標儀上用570 nm波長檢測各孔OD值。

1.3 細胞增殖率

將對數生長良好的骨骼肌細胞，分為3組：正常組、100 μM H2O2組(模型組)、100 μM H2O2+0.2 mg/mL APS組(干預組)，每組6個復孔并培養24 h。MTT法檢測(方法同上)。

增殖率(%)=(實驗組OD值-調零組OD值)/(對照組OD值-調零組OD值)×100%

1.4 細胞凋亡率

上述3組培養24 h后，用AnnexinV-FITC細胞凋亡試劑盒檢測。用胰酶消化細胞，PBS洗滌2次后重懸細胞，計數取1×106/mL細胞，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶染色液混勻，溫避光孵育10 min，流式細胞儀檢測。

1.5 細胞ROS水平

上述三組培養24 h后，用DCFH-DA探針標記法檢測。用胰酶消化細胞后，收集細胞懸浮于濃度為10 μM的DCFH-DA中，密度1×106/mL，37℃孵育20 min，用不含血清細胞培養液洗滌3次以除去DCFH-DA，流式細胞儀檢測。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 不同濃度的H2O2對骨骼肌細胞的影響

與正常組比較，100組、200組、300組和400組在12 h、24 h內骨骼肌細胞的增殖率均顯著下降(P<0.01)。見圖1。

注：與正常組比較，*P<0.01。圖1 不同濃度的H2O2對骨骼肌細胞的影響

2.2 各組增殖率、凋亡率、ROS水平的比較

與正常組比較，模型組和干預組的增殖率均下降，凋亡率和ROS水平均升高(P<0.01)。與模型組比較，干預組的增殖率上升，凋亡率和ROS水平均下降(P<0.01)。見圖2。

注：與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01。圖2 各組增殖率、凋亡率、ROS水平的比較

3 討論

衰老是一個依賴于時間的生理過程，也是人類慢性病發生和發展的最大風險因素。由于人類對預期壽命的增加，研究衰老變得尤為重要。人類在25周歲之后，骨骼肌質量就以3%～10%/10年的速度丟失。隨著年齡增長而發生的骨骼肌質量和功能的進行性減退，稱為骨骼肌減少癥，也稱肌肉減少癥(Sarcopenia)[1]，已被公認為老年綜合癥。大量研究指出，骨骼肌能夠控制其他組織代謝或衰老的速度，是年齡相關疾病(Age-related diseases，ARD)發展的重要危險因素，如代謝綜合征、阿爾茨海默氏癥、慢性心衰、癌癥等[5]。因此，骨骼肌是人體組織衰老的關鍵調節因子。

氧化還原紊亂導致肌肉萎縮的假設最早在1991年由Kondo等[5]提出。Pham等[6]研究發現，將肌細胞暴露于H2O2中，可使其蛋白質合成減少約90%。本實驗中，H2O2濃度在100 μM以上各組與正常組比較均有統計學意義(P<0.01)，提示100 μM H2O2是氧化應激骨骼肌細胞模型的有效濃度。隨著H2O2濃度的增加，骨骼肌細胞的增殖率顯著下降(P<0.01)。研究指出，ROS在骨骼肌中積累導致的氧化還原狀態改變，在肌肉減少癥中發揮重要作用[7]。本實驗用100 μM H2O2制作氧化應激骨骼肌細胞模型，結果顯示模型組的ROS水平及凋亡率均顯著升高(P<0.01)。

肌肉減少癥相當于中醫的“痿證”“虛勞”等證，主要病機為脾腎虧虛。《景岳全書·脾胃》曰：“精血之海，必賴后天為之資。故人自生至老，凡先天之有不足者，但得后天培養之力，則補天之功亦可居其強半。”由此可見，補脾益氣是延緩衰老的關鍵。中藥黃芪具有廣泛的藥理作用，包括抗氧化、延緩衰老、神經保護等[8]，APS是其主要活性成分占50%以上。本實驗予0.2 mg/mL APS干預后，骨骼肌細胞的增殖率顯著升高(P<0.01)，ROS水平及凋亡率均顯著下降(P<0.01)，與模型組比較有顯著性差異(P<0.01)。提示APS有良好的抗氧化，改善肌肉減少癥的作用，但具體的分子機制有待我們下一步的研究。