Beclin1、p62在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及與其預(yù)后的關(guān)系

楊振方

自噬現(xiàn)象在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮促進(jìn)和抑制的雙重作用，目前仍存在爭(zhēng)議[1-3]。Beclin1被認(rèn)為是一種抑癌基因，研究發(fā)現(xiàn)其生物學(xué)行為可能存在促癌的活動(dòng)，例如與p62結(jié)腸癌中的協(xié)同作用[4]。已有研究報(bào)道了結(jié)腸癌組織中Beclin1、p62的表達(dá)及其與臨床病理特征關(guān)系[5]，而結(jié)腸癌組織中Beclin1、p62的表達(dá)及其與預(yù)后關(guān)系鮮見報(bào)道。本研究旨在觀察結(jié)腸癌組織中免疫組化Beclin1、p62染色情況，并探討其與結(jié)腸癌患者生存預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2016年5月至2017年10月我院保存的55例手術(shù)切除的結(jié)腸癌石蠟包埋標(biāo)本。所有組織標(biāo)本經(jīng)活檢證實(shí)為結(jié)腸癌，所有病例有完整隨訪資料、術(shù)前未接受過(guò)放化療。每例標(biāo)本取癌組織和癌旁正常黏膜組織(距腫瘤邊緣>5 cm)。其中，年齡(48～75)歲，平均(60.55±5.28)歲；性別：男性35例，女性20例；組織學(xué)分型：腺癌18例，黏液腺癌37例；TNM分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期28例，Ⅲ期13例，Ⅳ例10期；發(fā)病部位：左半結(jié)腸28例，右半結(jié)腸27例；遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有14例，無(wú)41例。

1.2 免疫組化染色

組織標(biāo)本均采用多聚甲醛固定，在病理切片前用磷酸緩沖液梯度脫水，病理切片后用二甲苯進(jìn)行脫蠟，再以酒精梯度脫水，過(guò)氧化氫滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，放置病理標(biāo)本恒溫柜中孵育10 min(環(huán)境溫度27 ℃)，一抗過(guò)夜處理(Beclin1兔多抗、p62鼠單抗)，鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶法放大一抗的信號(hào)，再次放置病理標(biāo)本恒溫柜中孵育60 min(環(huán)境溫度27 ℃)，二氨基聯(lián)苯胺顯色，滴加檸檬酸組織抗原修復(fù)液，封片后用顯微鏡觀察染色結(jié)果。

1.3 結(jié)果判定 Beclin1陰陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性，呈淡藍(lán)色樣則判定為陰性。p62陰陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒判定為陽(yáng)性，無(wú)染色則判定為陰性。讀取3個(gè)400倍視野下的Beclin1、p62陽(yáng)性染色細(xì)胞計(jì)數(shù)，取其平均值。染色細(xì)胞強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)染色記0分，淡黃色顆粒記1分，黃色顆粒記2分，棕黃色顆粒記3分；染色細(xì)胞比例評(píng)分：陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)<25%記0分，25%～50%記1分，51%～75%記2分，≥76%記3分。染色細(xì)胞強(qiáng)度評(píng)分和染色細(xì)胞比例評(píng)分的和等于0分為陰性(-)、(1～2)分為弱陽(yáng)性(+)、(3～4)分為中強(qiáng)陽(yáng)性(++)、(5～6)分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。陽(yáng)性率=(-)+(++)+(+++)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 20.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。死亡定義為終點(diǎn)事件，生存時(shí)間為手術(shù)日期至死亡日期。計(jì)算生存率采用 Ka-plan-Meier方法，生存率比較應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)；多因素預(yù)后分析采用COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中Beclin1染色情況比較

結(jié)腸癌組織中Beclin1陽(yáng)性表達(dá)率顯著低于癌旁正常黏膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 結(jié)腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中Beclin1表達(dá)情況比較(例，%)

2.2 結(jié)腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中p62表達(dá)情況比較

結(jié)腸癌組織中p62陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁正常黏膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 結(jié)腸癌組織和癌旁正常黏膜組織中p62表達(dá)情況比較(例，%)

2.3 單因素生存分析

Beclin1陽(yáng)性病例5年生存率為71.42%(10/14)，陰性則為26.47%(9/34)；p62陽(yáng)性病例5年生存率為28.20%(11/39)，陰性則為63.63%(7/11)。Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Beclin1表達(dá)與生存期呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；p62表達(dá)與生存期呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

2.4 多因素生存分析

以Ka-plan-Meier結(jié)果為應(yīng)變量，以性別(0=男、1=女)、年齡(連續(xù))、發(fā)病部位(0=左半結(jié)腸、1=右半結(jié)腸)、病理分級(jí)(0=G1、1=G2、2=G3)、TNM分期(0=Ⅰ期、2=Ⅱ期、3=Ⅲ期、4=Ⅳ期)、遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(0=有、1=無(wú))、Beclin1(0=陰、1=陽(yáng))、p62(0=陰、1=陽(yáng))為協(xié)變量，代入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析后發(fā)現(xiàn)，Beclin1是結(jié)腸癌患者獨(dú)立的生存預(yù)后因素(B=-0.926，RR=0.314，P<0.05)；p62是結(jié)腸癌患者獨(dú)立的生存預(yù)后因素(B=1.521，RR=4.337，P<0.05)。

3 討論

自噬現(xiàn)象是調(diào)控自噬的相關(guān)基因利用細(xì)胞溶酶體消化細(xì)胞自身的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的過(guò)程。Beclin1是調(diào)控自噬的相關(guān)基因，Beclin1蛋白是1種調(diào)節(jié)自噬現(xiàn)象的蛋白質(zhì)，其通過(guò)與Class Ⅲ PI3K結(jié)合來(lái)介導(dǎo)自噬體的形成[6]。研究報(bào)道，肺癌、胃癌及結(jié)腸癌細(xì)胞中存在Beclin1等位基因的缺失現(xiàn)象[7-9]；結(jié)腸癌、前列腺癌及甲狀腺癌等實(shí)體瘤組織中存在不同程度的Beclin1 mRNA表達(dá)下調(diào)[10-12]。本研究觀察到，結(jié)腸癌組織中Beclin1陽(yáng)性表達(dá)率比癌旁正常黏膜組織低，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。說(shuō)明，Beclin1基因缺失或點(diǎn)突變可降低結(jié)腸癌細(xì)胞的自噬性死亡能力，結(jié)腸癌細(xì)胞的自噬性死亡能力明顯低于癌旁正常黏膜組織細(xì)胞。

Beclin1與p62在結(jié)腸癌發(fā)病過(guò)程中具有協(xié)同作用，Beclin1基因缺失或點(diǎn)突變使自噬發(fā)生缺陷時(shí)，可使自噬底物p62聚集，p62通過(guò)介導(dǎo)NF-κB信號(hào)途徑導(dǎo)致腫瘤[13-15]。本研究觀察到，結(jié)腸癌組織中p62陽(yáng)性表達(dá)率比癌旁正常黏膜組織高，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有意義。提示，p62不但參與了結(jié)腸癌的發(fā)病，而且p62是Beclin1基因所調(diào)控通路自噬活性的生物標(biāo)志物。

本研究觀察到，Beclin1表達(dá)與生存期呈顯著正相關(guān)，p62表達(dá)與生存期呈顯著負(fù)相關(guān)。提示，Beclin1、p62可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生和進(jìn)展，結(jié)腸癌組織中Beclin1的表達(dá)下調(diào)、p62的表達(dá)上調(diào)，有增加死亡風(fēng)險(xiǎn)的趨勢(shì)。本研究同時(shí)觀察到，Beclin1、p62是結(jié)腸癌患者獨(dú)立的生存預(yù)后因素。提示，Beclin1陽(yáng)性是結(jié)腸癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素；p62陽(yáng)性是結(jié)腸癌患者生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。由此，Beclin1、p62可作為生物標(biāo)志物，為結(jié)腸癌患者生存預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

綜上所述，本研究探討了結(jié)腸癌組織中Beclin1、p62的表達(dá)及其與預(yù)后關(guān)系。