循環腫瘤細胞在肺癌中的表達及其臨床意義研究

駱許靜 馬耀先 孫 楨 方曉瑞 申曉燕

肺癌是1種全世界范圍內常見的惡性腫瘤，它起源于支氣管黏膜及腺體，發病率極高，其發病率及死亡率高居惡性腫瘤之首，并且其發病率逐年升高[1]，2017年的研究數據表明，全國惡性腫瘤發病第1位的是肺癌，每年新發病例約73.3萬[2]。目前，傳統診斷有局限性[3]，不能檢測到循環血液中的癌細胞和其他器官中的微小轉移灶，許多患者因遠處器官和組織的轉移而復發，部分初期肺癌將會發展為晚期的肺癌，給患者帶來極大的痛苦。早發現、早診斷、早治療，提前控制病情是治療肺癌有效方法，但由于該疾病前期癥狀不明顯，亟需1種靈敏的診斷方法[4]。循環腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTC)是從原發腫瘤或者轉移灶上脫落后進入血液循環的腫瘤細胞，CTC在腫瘤的研究中得到廣泛的應用[5]，CTC逐漸體現出多種癌癥診斷方面的價值[6]。研究顯示[7-8]， CTC檢測在肺癌中也表現較好的敏感性和特異性。本研通過CTC檢測與臨床相結合，探討CTC檢測對診斷肺癌疾病及其轉歸的臨床價值，以期CTC能夠在肺癌診斷、治療和預后評估中得到更廣泛的應用，為醫學界同仁提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

肺癌患者組：選取自2016年3月至2017年5月在我院就診的60例肺癌患者,其中男性26例,女性34例，平均年齡為62.2歲，38～80歲。納入標準：①經胸部CT掃描及其他組織病理學檢查確診為肺癌患者；②年齡在18～80歲；③入組前未接受任何抗腫瘤治療。非結核的肺良性疾病患者組：選取自2016年3月至2017年5月在我院就診的10例肺良性疾病患者，其中男性7例，女性3例，平均年齡為61.9歲，37～80歲。納入標準：①病理學檢查排除肺惡性腫瘤；②符合非腫瘤相關疾病臨床診斷標準；③有微生物學或組織學證據。另選取健康志愿者10例，男性6例，女性4例，平均年齡為53歲(28～69歲)。三組受試者在性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。所有受試者均簽署了知情同意書,經倫理委員會審查通過。根據胸部CT、B超和纖維支氣管鏡的臨床檢測結果，其中小細胞肺癌患者11例，非小細胞肺癌患者49例；依據第八版國家肺癌TNM分期標準，其中Ⅰ期10例、Ⅱ期21例、Ⅲ期17例、Ⅳ期12例。

1.2 方法

首先采集所有患者靜脈血7.5 ml，加入到ACD抗凝試管。加入6.5 ml磷酸鹽緩沖液混入其中，充分搖勻，以2000 rpm室溫離心15 min，離心3次。將富積到的細胞均勻涂在玻片上，使用抗體混合液(人鼠抗Pan-細胞角蛋白CK，生產廠家:上海賓智生物科技有限公司)和封片液(4，6-二脒基-2-苯基吲哚購自invitrogen公司)染色。最后采用免疫熒光顯微鏡(購自雅培公司)進行觀察，查找腫瘤細胞。以對數生長的肺腺癌A549細胞株為陽性對照組，以PBS代替一抗為陰性對照組，防止樣本出現異常現象，如樣本紅細胞裂解不完全導致成團、樣本紅細胞裂解后溶血。整個過程注意無污染、避光操作。

1.3 CTC的判定標準

形態學標準：①細胞呈圓形、橢圓形或長形，體積明顯大于血細胞；②光鏡下可見完整細胞形態。CTC免疫熒光染色結果判定：可以同時被CK和DAPI染色，不能被CD45染色。目前尚無國際標準化的陽性判定標準，本試驗以見到CTC即為陽性結果。出現陽性結果的患者在整個組中的比率即為陽性率。

1.4 統計學方法

應用SPASS 20.0軟件對獲得的實驗數據進行統計分析，計量組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺癌患者組、良性肺疾病患者組和健康空白對照組中CTC數量統計結果

肺癌患者組中CTC陽性率達80%(48/60),在良性肺疾病患者組和健康空白對照組中CTC陽性率為零，差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 不同類型肺癌及不同分期肺癌患者CTC陽性率的分析

不同的肺癌類型CTC陽性率比較發現，循環細胞的陽性率與性別、肺癌類型無明顯關系(P>0.05),而Ⅰ期肺癌患者中CTC陽性率(40.00%)顯著低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者的CTC陽性率(85.71%、88.24%、100.00%)，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同類型及不同分期肺癌患者CTC陽性表達情況(例，%)

3 討論

近年來肺癌的發病率不斷升高，肺癌轉移與擴散也越來越復雜，傳統的肺癌檢測手段精確度與靈敏度受到一定的挑戰，臨床上頻繁出現肺癌的誤診情況[9-10]，不斷有研究者對傳統的診斷手段提出質疑，并且傳統的檢查方法很容易對患者造成有創傷害。為了能夠減少臨床誤診情況，更加合理的對肺癌患者進行診斷、治療、預后評估，需要綜合運用多種檢測技術對患者進行多角度、全方位、深層次的診斷[11]。檢測肺癌患者血液中循環腫瘤細胞手段作為一種新的肺癌的判斷方法越來越受大家重視，是目前臨床研究的熱點[12]。CTC的檢測手段已在乳腺癌中得到廣泛的應用[13]，其符合率達到95%～100%，并且對卵巢癌、晚期直腸癌和前列腺癌的診斷、治療、預后評估具有指導作用[14]。隨著Ficoll離心法和免疫磁珠法等CTC富集技術，流式細胞計數和聚合酶聯反應等CTC鑒定技術以及CTC芯片技術的應用[15]，CTC的檢測的敏感性和特異性越來越高[16-17]。若這些新技術的能廣泛應用于臨床，將會極大有助于肺癌的診治和預后判斷，預測肺癌的轉移情況，盡早采取有效的治療措施，提高肺癌患者的存活率。

我們通過對60例肺癌患者、10例良性肺疾病患者、10例健康對照著中外周血CTC的數量進行研究，統計結果顯示肺癌患者的CTC陽性率明顯高于良性肺疾病和健康對照組。并對不同性別和不同肺癌類型的CTC陽性率進行比較，其差異不具有統計學意義(P>0.05)，而不同肺癌分期的CTC陽性率差異具有統計學意義(P<0.05)。此研究結果與陳燕、鐘光華等人的研究結果基本一致[18-19]。說明CTC檢測具有一定的穩定性、準確性和可重復性。但是CTC的評判標準和方法并未統一，為CTC檢測的廣泛應用帶來一定困難，因此進一步提升肺癌中CTC檢測的臨床應用價值對肺癌患者的診斷、治療和預后評估具有重大的臨床意義。