可降解多孔純鋅支架表面Mg-P生物活性涂層的制備與表征

侯 懿，賈高智，黃 華，袁廣銀

(上海交通大學 輕合金精密成型國家工程研究中心，上海 200240)

近幾年，鋅合金作為一種新型可降解醫用金屬材料受到了廣泛的關注[1-4].鋅是人體所必需的微量元素之一，對細胞生長和分化、免疫系統以及神經系統都起著重要的調節作用[5-6].此外，相比于鎂合金，鋅合金因擁有更適中的低降解速率而更適于用作可降解多孔支架的材料.但是，由于多孔結構對降解的加速作用導致Zn2+快速大量釋放，多孔鋅表現出較強的體外細胞毒性.而理想的骨組織工程支架材料，必須具備良好的生物相容性[7-8]，以保證前期種子細胞的體外黏附、鋪展、增殖、分化等基本細胞活動以及后續組織的長入.因此，為了成功地將多孔鋅應用于骨組織工程，必須進一步地提高多孔鋅的細胞相容性.

表面涂層是一種有效改善材料表面耐腐蝕性能和生物相容性的技術，其在生物醫用可降解鎂合金表面已經取得了顯著成效.Wang等[9]采用脈沖電化學沉積法在Mg-Zn-Ca合金表面制備了一層缺鈣型的羥基磷灰石(HA)涂層，HA涂層與鎂合金基體的結合強度高達41.8 MPa.涂層覆蓋后，合金的耐腐蝕性能顯著提高，極限抗拉強度高于裸金屬，合金的服役時間得到延長.Niu等[10]利用化學轉化法在JDBM(Jiao Da Bio-Magnesium)鎂合金表面制備了一層二水磷酸氫鈣(DCPD)涂層，涂層與基體的結合力超過10 MPa.DCPD涂層不僅能夠有效增強JDBM鎂合金在 Hank’s 溶液中的抗腐蝕性能，還顯著降低了合金表面的溶血率，提高了合金對成骨細胞的相容性.同時，動物實驗結果也證實了Ca-P涂層能夠顯著降低前期JDBM鎂合金骨板、骨釘的降解速率和氫氣釋放量，使骨板、骨釘的力學完整性延長10周以上.此外，與磷酸鈣類涂層相似，磷酸鎂類涂層也具有良好的生物相容性，并且能夠激活成骨細胞的分化與功能、促進新骨的形成，是很有前景的骨科植入材料的表面改性涂層[11-12].Ishizaki等[13]結合化學和低熱處理方法在AZ31鎂合金表面制備一層50 μm厚的磷鎂石(MgHPO4·3H2O)涂層，涂層覆蓋后AZ31合金的腐蝕電流密度下降了2個數量級，且涂層顯示出良好的親水性.

然而，現階段對于可降解鋅合金的研究大都還停留在對合金體系的開發上[4]，鮮有關于可降解醫用鋅合金表面涂層的研究報道.顯然，較高濃度的Zn2+所引起的較強的體外細胞毒性[14-15]，是將多孔鋅合金進一步推向骨組織工程的臨床應用所必須要解決的問題之一.針對該問題，本文采用化學轉化法在孔隙率為75%的多孔純鋅樣品表面成功制備了一種Mg-P生物活性涂層，表征了涂層的形貌、厚度、成分和結合力，并且對有或無涂層覆蓋的多孔純鋅樣品的降解行為和細胞的相容性進行了系統的對比研究.

1 材料制備與試驗方法

1.1 材料和涂層的制備方法

以滲流鑄造法制備所得的孔隙率約為75%的多孔純鋅樣品為研究對象，采用化學轉化法在該多孔純鋅表面制備了具有生物活性的Mg-P涂層.具體操作過程如下：

(1)預處理.在超聲條件下，將多孔純鋅樣品用60 ℃ 的0.5 mol/L的NaOH和Na2CO3混合溶液清洗15 s，以去除表面的油脂和部分氧化皮，隨后用去離子水和無水乙醇沖洗干凈，晾干待用.

(2)將預處理好的多孔純鋅樣品浸泡在Mg-P處理溶液中(配方見表1)12 h后，取出清洗并晾干，即獲得覆蓋有Mg-P涂層的多孔純鋅樣品.

表1 Mg-P涂層處理溶液配方Tab.1 The composition of Mg-P treating solution

1.2 涂層的表征

采用掃描電子顯微鏡(SEM，FEI，美國)觀察了Mg-P涂層覆蓋后多孔純鋅的表面和截面形貌，并利用EDS能譜附件(Oxford INCA,英國)以及XRD衍射儀(D/MAX 2550 Rigaku,日本)分析了其表面化學元素和物相組成.隨后，采用劃痕法測試了Mg-P涂層與純鋅基體的結合力.根據阿基米德原理，利用密度天平測定了有無涂層的多孔鋅樣品的孔隙率.

1.3 浸泡試驗

首先將尺寸為?10 mm×2 mm的多孔純鋅樣品用體積分數φ=75%的酒精消毒20 min以上，然后轉移至超凈臺內，正反兩面分別用紫外線照射 2 h.將消毒好的樣品放置在12孔細胞培養板內，加入3 mL DMEM培養液，然后放入細胞箱中(37 ℃，φ(CO2)=5%).每0.5周更換一次培養液，測定浸提液的pH值、滲透壓以及Zn2+濃度.

1.4 細胞毒性評價

利用有或者無涂層的多孔純鋅樣品的浸提液間接地評價了其對MC3T3-E1細胞的細胞毒性.細胞培養采用DMEM培養基(Gibco,美國)，并加入φ=10%的胎牛血清(FBS，Gibco，美國)和φ=1%的青霉素/鏈霉素(雙抗P/S(Gibco,美國)，原始濃度為 10 000 U/mL，配制后的濃度為100 U/mL，其中U是抗生素的效價單位)，培養箱的環境溫度為37 ℃，φ(CO2)=5%.試驗使用第3～8代細胞，以保證細胞的活性.

浸提液的制取參照ISO 10993-5:1999標準進行.將消毒后?10 mm×2 mm的多孔純鋅支架按照1.25 cm2/mL 的比例浸泡在DMEM培養液中(多孔樣品的表面積按其等尺寸的塊體樣品表面積計算)，放入培養箱中處理72 h.取上清液經0.22 μm孔徑的無菌濾器過濾后，再加入φ=10%的FBS和100 U/mL的P/S，即得到浸提液(φ=100%).使用含FBS和P/S的DMEM可進一步將浸提液稀釋至φ=10%.

試驗過程：將細胞以2×104個/mL的濃度接種到96孔板內，每孔100 μL，置于細胞培養箱內培養24 h，使細胞充分貼壁.隨后用100 μL的浸提液替換原來的培養液，培養到1、3、5 d時，每孔加入10 μL cck-8試劑(碧云天，中國)，繼續培養2 h后，用酶標儀測定試驗組和對照組在450 nm波長處的吸光度(OD)，根據吸光度結果計算細胞活性：

(1)

式中：下標N表示陰性組，為采用完全培養基培養的細胞；下標O表示空白組，為不含細胞的培養基；下標E表示試驗組.

圖1 Mg-P涂層覆蓋前后多孔純鋅樣品表面的微觀形貌(SEM照片)Fig.1 The SEM micrograph of porous pure Zn scaffolds

1.5 細胞黏附試驗

細胞黏附試驗是將細胞直接種植在樣品表面，通過觀察細胞在材料表面的黏附與增殖情況，來研究材料表面的細胞相容性.首先將消毒后的多孔純鋅樣品置于含FBS的DMEM培養基中浸泡2 h，使蛋白充分黏附在樣品表面.隨后將預泡好的多孔鋅樣品置于12孔板內，取100 μL配置好的MC3T3-E1細胞懸液(密度為1×106個/mL)滴加在樣品表面，放入培養箱孵育20 min后，加入4 mL DMEM培養基，再放回細胞培養箱內繼續培養12 h、3 d、7 d后，用Live/Dead試劑盒(Invitrogen，美國)對細胞進行染色，并在熒光顯微鏡(奧林巴斯IX71，日本)下觀察細胞的黏附形態(Live/Dead染料配方：5 mL PBS+10 μL EthD-1+2.5 μL Calcein-AM).

2 結果與討論

2.1 涂層的表征及其形成機制

圖1所示為有無涂層的多孔純鋅樣品的表面SEM形貌照片.由圖可見：原始多孔純鋅樣品呈現三維貫通的開孔結構且孔壁表面較為光滑，僅存在少量的氧化皮(圖1(a)和(b))；Mg-P涂層樣品依舊保持原始多孔鋅樣品的開孔結構，但其表面均勻覆蓋了一層結晶狀涂層(圖1(c)和(d))；低倍SEM照片中(圖1(c))，Mg-P涂層呈現團簇狀結構，均勻地鋪展在多孔純鋅樣品表面；在高倍SEM照片中(圖1(d))可以清晰地觀察到每一簇都是由更為細小的條束狀涂層晶粒以發散式取向堆積而成，團簇結構之間以相互抵觸的方式銜接覆蓋在整個多孔純鋅樣品表面.

圖2 顯示Mg-P涂層與鋅基體結合力的SEM照片Fig.2 The SEM micrograph for the adhesion of Mg-P coatings to zinc substrate

從 Mg-P涂層樣品的截面SEM圖片(見圖2(a))可以發現：Mg-P涂層與多孔純鋅基體表面之間的結合十分致密，不存在明顯孔隙；結合面凹凸不平，說明在涂層形成過程中多孔純鋅表面發生了溶解；涂層的厚度不完全均勻，平均厚度約為10 μm.無涂層多孔鋅樣品的孔隙率為(76.06±0.6)%，而涂層覆蓋后樣品的孔隙率變為(71.49±0.62)%，下降了約4.5%.圖2(b)所示為采用劃痕法測試涂層與純鋅基體之間結合力后的表面形貌，可以發現測試后在劃痕附近的涂層依然與純鋅基體緊密結合，幾乎沒有涂層剝落的現象，說明Mg-P涂層與純鋅基體之間的結合力較強.采用化學轉化法制備的涂層與基體能夠形成化學結合，因而往往具備較強的結合力，而且Mg-P涂層與基體之間的結合部位十分致密，完全不存在任何的孔洞(見圖2(a))，也能夠保證其具備較強的結合力.

圖3(a)所示為Mg-P涂層樣品表面的EDS能譜分析結果，Mg-P涂層的主要成分為C、O、Mg、P以及Zn元素，涂層極有可能為含Mg的磷酸鹽；圖3(b)所示為Mg-P涂層的XRD譜圖，進一步證實Mg-P涂層主要成分為(Mg0.62Zn0.38)Zn2(PO4)2·4H2O和Zn3(PO4)2·4H2O.

圖3 Mg-P涂層樣品表面的EDS能譜分析和XRD譜圖Fig.3 The EDS and XRD spectra of the surface of Mg-P coated porous pure Zn sample

Kouisni等[16]使用Na2HPO4、H3PO4、NaNO3、NaNO2以及Zn(NO3)2的混合溶液處理AM60鎂合金表面，在合金表面形成了一層結晶狀的 Zn3(PO4)2·4H2O涂層，并研究了其形成機制.當AM60鎂合金浸泡在磷酸鹽處理溶液中后，隨著其表面的Mg發生陽極溶解產生Mg2+，

(2)

在陰極位置發生如下反應：

(3)

從而導致局部的pH值上升，誘導Mg3(PO4)2和 Zn3(PO4)2·4H2O 分別以下述過程形核：

(4)

Zn3(PO4)2·4H2O+3H2↑

(5)

隨著Mg的繼續溶解，式(4)和(5)的形核過程向右方向進行，但只有Zn3(PO4)2·4H2O晶粒能夠優先生長不斷變大，隨后相互接觸在鎂合金表面形成一層相對致密的Zn3(PO4)2·4H2O涂層.

(6)

在陰極位置處H+被還原產生H2(式(3))，導致局部的pH值上升，這將有利于難溶磷酸鹽的析出過程[17].此時，Zn3(PO4)2·4H2O依舊按照式(5)的方式析出形核，而溶液中存在的Mg2+能夠參與到Zn3(PO4)2·4H2O的形核與長大過程中，從而在涂層中生成了(Mg0.62Zn0.38)Zn2(PO4)2·4H2O，

50(Mg0.62Zn0.38)Zn2(PO4)2·4H2O+119H2

(7)

隨著反應的不斷進行，涂層晶粒相互接觸形成一層完整的涂層并不斷地增厚，直到溶液中的反應離子濃度下降到平衡濃度時涂層停止生長.

2.2 涂層對多孔純鋅降解行為的影響

圖4所示為有無涂層的多孔純鋅樣品浸泡在DMEM培養液中的Zn2+質量濃度(ρZn2+)、pH和滲透壓(p)隨浸泡時間(t)的變化情況.由圖4(a)可知，Mg-P涂層覆蓋后多孔純鋅的Zn2+釋放速率顯著降低，尤其在第1周最為明顯，其Zn2+釋放量僅為無涂層多孔鋅樣品的0.2～0.3倍.這是因為Mg-P涂層覆蓋后能夠有效地將溶液與鋅基體表面隔離開來[18]，從而起到降低多孔鋅基體表面溶解速率的作用.隨著浸泡時間延長，無涂層的多孔鋅樣品的Zn2+釋放速率逐漸降低，到第4周時約為最初的1/3，這表明浸泡在DMEM培養液中后，多孔鋅表面能夠逐漸生成一層腐蝕產物，起到一定的保護作用，且隨著浸泡時間的延長，該保護層逐漸致密且不斷加厚，使其保護效果越來越好[19].而Mg-P涂層樣品的Zn2+離子釋放速率一直保持在一個比較低的水平，呈現出良好的抑制腐蝕降解的效果.

圖4 有無涂層的多孔純鋅樣品在DMEM培養液中的浸泡試驗結果Fig.4 The immersion test of porous pure Zn scaffolds with and without Mg-P coating in DMEM

從圖4(b)可以發現，浸泡過程中有無涂層樣品浸提液的pH值都比原始DMEM培養液稍有升高，尤其在前2周較為明顯，但最高時均未超過8.1.同時，有無涂層的多孔純鋅樣品的浸提液滲透壓也均較原始DMEM高(見圖4(c))，滲透壓的升高表明有離子或分子溶入DMEM中，無涂層樣品的滲透壓比Mg-P涂層處理后樣品的更高，這正好與Zn2+的釋放量相對應.

2.3 涂層對多孔純鋅細胞毒性的影響

采用浸提液法間接評價了有無涂層的多孔純鋅樣品對MC3T3-E1細胞的細胞毒性.表2所示為有無涂層樣品浸提液的pH、滲透壓和Zn2+質量濃度.浸提液的pH值、滲透壓以及Zn2+質量濃度都明顯高于原始的DMEM培養液，且無涂層樣品的相應參數值比Mg-P涂層支架更高，這與浸泡試驗結果相對應.

表2 多孔純鋅樣品浸提液的相關參數Tab.2 The parameters of porous pure Zn samples

圖5 多孔純鋅支架對MC3T3-E1細胞的細胞毒性Fig.5 The cytotoxicity evaluation of porous pure Zn scaffolds to MC3T3-E1 cells

有研究者提出采用浸提液法評價可降解材料的細胞毒性時，應適當地將其浸提液稀釋6～10倍以更好地模擬體內環境[20].用φ=10%的浸提液培養MC3T3-E1細胞的細胞毒性的結果如圖5所示，可見：無涂層多孔純鋅樣品的細胞活性僅在第1天超過90%，第3天和第5天分別下降到了約50%和30%，說明無涂層樣品φ=10%的浸提液依舊具有一定的細胞毒性；而Mg-P涂層樣品的細胞活性在第1天超過了100%，雖然第3天和第5天稍有下降，但均在85%以上，說明φ=10%的Mg-P涂層樣品浸提液基本無細胞毒性，Mg-P涂層顯著提高了多孔純鋅的細胞相容性.現有研究結果表明低濃度的Zn2+能夠促進成骨[21]，但是較高濃度的Zn2+具有較強的細胞毒性[14].無涂層多孔純鋅樣品和Mg-P涂層樣品φ=10%的浸提液的Zn2+質量濃度分別為9 μg/L和5.5 μg/L，這說明當培養液中的Zn2+質量濃度小于5.5 μg/L時，對MC3T3-E1細胞不產生明顯毒性.根據以上分析可知，具有生物活性Mg-P涂層能夠有效降低多孔純鋅樣品的Zn2+釋放速率，從而大大提高其細胞相容性，具有潛在的應用價值.

圖6 MC3T3-E1細胞在裸多孔純鋅支架上直接培養不同時間的Live/Dead染色照片Fig.6 The morphology of MC3T3-E1 cells adhering on the surface of the porous pure Zn samples without Mg-P coating by Live/Dead staining

2.4 涂層對多孔純鋅表面細胞黏附和增殖行為的影響

圖6和7所示為MC3T3-E1細胞在有無涂層的多孔純鋅樣品上直接培養12 h、3 d和7 d后的Live/Dead染色照片.在無涂層多孔鋅表面，由于Zn2+釋放較快，導致樣品表面Zn2+濃度和pH值較高，細胞沒能黏附到樣品表面，培養到12 h時，細胞已全部呈球形且均已死亡.隨著培養基的不斷更換，死細胞被不斷地帶走，到第3天和第7天時，樣品上已基本觀察不到細胞.對于Mg-P涂層樣品，培養12 h時，樣品表面的大部分細胞還活著，且黏附形態不錯，說明Mg-P涂層能夠顯著提高多孔純鋅表面的細胞相容性，但此時樣品上已經出現少量死細胞；當培養到第3天時，樣品表面細胞明顯較12 h時少，且僅有少量細胞呈現鋪展形態，大部分細胞呈現為球形；到第7天時，樣品表面細胞全都呈現為球形且已經死亡.這表明盡管Mg-P支架提高了多孔純鋅表面的細胞相容性，但其表面的物理化學環境依舊不適合MC3T3-E1細胞的長期黏附與增殖.

圖7 MC3T3-E1細胞在有Mg-P涂層的多孔純鋅支架上直接培養不同時間的Live/Dead染色照片Fig.7 The morphology of MC3T3-E1 cells adhering on the surface of the porous pure Zn samples with Mg-P coating by Live/Dead staining

通常，細胞的黏附、鋪展和增殖行為會受到很多界面性能的影響，譬如表面化學性質和表面形貌[18].Mg-P涂層能夠在一定程度上抑制Zn2+從多孔純鋅表面釋放，從而降低多孔純鋅表面的局部Zn2+濃度，提高多孔純鋅的細胞相容性.同時，相比于光滑表面，成骨細胞在微米級的粗糙表面上的黏附行為和功能性更好，有研究發現當粗糙度Ra>2 μm時，隨著粗糙度的增加，MC3T3-E1細胞的骨橋接蛋白表達隨之上升[22].從SEM照片可見，Mg-P涂層的粗糙度明顯大于5 μm，這也能對MC3T3-E1細胞的黏附起到一定的促進作用.但由于Mg-P涂層的厚度僅有10 μm，對多孔鋅的保護作用依舊不足，其表面的Zn2+濃度還是不適宜MC3T3-E1細胞的長期黏附.因此，后期研究可以通過調整涂層的制備工藝來增加涂層的厚度和致密度，以更進一步地提高多孔純鋅的生物相容性，使其滿足臨床應用需求.

3 結論

利用化學轉化法成功地在多孔純鋅表面制備了一層Mg-P生物活性涂層，系統地表征了涂層的形貌、成分、厚度和結合力，并研究了涂層對可降解多孔純鋅的降解行為和細胞相容性的影響.根據研究結果可以得出以下結論：

(1)Mg-P涂層由細小的條束狀涂層晶粒以發散式取向堆疊而成的團簇構成，團簇之間相互抵觸銜接，覆蓋在整個多孔鋅表面.

(2)涂層與純鋅基體之間形成致密的化學結合，結合力較強，涂層的平均厚度約為10 μm；涂層覆蓋后多孔純鋅樣品的孔隙率下降了約4.5%，但依舊保持良好的連通性.

(3)Mg-P涂層能有效降低多孔純鋅樣品前期的Zn2+釋放速率，從而提高多孔純鋅的細胞相容性，具有很好的應用前景.