麗江滇重樓和白芨根腐病病原菌鑒定

趙彩呈， 洪英娣， 劉 麗， 張珍蔭， 熊正勇， 伍建榕*

(1.西南地區生物多樣性保育國家林業局重點實驗室，云南 昆明 650224； 2.西南林業大學 云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224； 3.云南省玉龍納西族自治縣森林病蟲防治檢疫站，云南 麗江 674100； 4.云南省寧蒗縣林業局，云南 寧蒗 674300)

滇重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)也稱七葉一枝花，屬百合科，具有消腫止痛、清熱解毒和抑菌的作用，可以用于醫治咽喉腫痛、跌打損傷、止血祛痰等癥狀，臨床上可有效止血，治療外科炎癥、神經性皮炎等。白芨(Bletillastriata)為蘭科白芨屬植物，花葉可供觀賞，莖含大量具有特殊黏度特性的白芨膠，可應用于化妝品中，根則是珍貴的中藥材原料，能夠有止血凝血、消腫止痛等作用。隨著滇重樓、白芨的集約化種植，品種退化和病蟲害嚴重影響其產量和質量[1-6]。目前，對滇重樓的研究大多在分類、栽培技術、化學成分和藥理作用等方面[7]，在病蟲害防治方面特別是病害國內外相關報道較少[8-10]，而滇重樓和白芨根腐病在生產中發生普遍，是危害滇重樓和白芨的主要病害之一。因此，對滇重樓和白芨根腐病病原進行鑒定，以期為該病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 滇重樓和白芨樣品采于麗江市玉龍縣太安鄉和寧蒗縣甘海子村的重樓及白芨種植基地。

1.1.2 主要試劑真菌試劑盒為E.Z.N.ATMFungal DNA Kit(100)和D3390-01 (Omega Biotek)；ITS1、ITS4通用引物；PCR擴增混合液為2×Power Taq PCR Master Mix，BM2000 DNA Marker；DM0101(Biomed)；DDH2O；1×TAE緩沖液；瓊脂糖；DNA stains。

1.1.3 儀器及工具 電泳儀、微波爐、凝膠成像儀、冷凍離心機、數顯恒溫水浴鍋、分析天平、旋渦混合器、液氮罐(10 L)、PCR自動化系列分析儀、制冰機、基因槍等病原菌的分離和鑒定

1.1.4 培養基馬鈴薯瓊膠培養基(PDA)，配方：洗凈去皮馬鈴薯200 g，煮30 min，用紗布濾去馬鈴薯，加蒸餾水補足1 000 mL，加入葡萄糖或蔗糖20 g、瓊膠20 g加熱至完全融化后，于121℃高壓滅菌20 min，冷卻至55℃左右加入0.03 g/L鏈霉素，混合均勻后倒平板待用。

1.2 病原菌的分離與培養

1.2.1 根樣處理將根部樣品流水沖洗4 h，用毛刷輕輕刷去表面泥土，在超凈工作臺上將病根置于75%酒精浸泡30 s進行表面消毒后，置于0.1%升汞消毒3 min，無菌水沖洗數次后置于滅菌濾紙吸干，最后放于PDA培養基25oC下進行培養。

1.2.2 病原真菌的純化病原菌在25℃黑暗條件下培養5～7 d，待菌絲從病根上長出后，將長出的菌絲挑至PDA培養基上繼續培養5～7 d，獲得純化菌株，接種在試管PDA斜面上，4℃冰箱保存備用。

1.2.3 病原菌的形態學鑒定對純化后的病原菌拍照、記錄分離到的菌株數，參考MCLEAN等對菌落特征進行描述，測量菌落大小、記錄菌落顏色、質地等形態特征。根據菌落形態特征，參考《真菌鑒定手冊》和《真菌分類學》，對分離到的病原菌進行初步的分類、鑒定。

1.2.4 病原菌 ITS-分子序列鑒定

1) 菌株培養及采集。將-4℃條件下保存的純化菌株轉接于PDA培養基上活化，于25℃培養箱中避光培養3～7 d。待菌絲生長充足后于超凈工作臺上用無菌簽刮下1～2 g菌絲放入1.5 mL離心管中，于-20℃冰箱中保存備用。

2) 菌株DNA的提取。利用真菌試劑盒提取分離菌的DNA：將裝有菌絲的1.5 mL離心管置于液氮中，速凍后用研磨棒迅速將菌絲研磨至粉末狀備用，DNA提取方法參照試劑盒內說明書。

3) PCR反應。反應體系25 μL：DNA 模板5 μL約50 ng，Mg2+濃度為1.5 mmol/L，dNTPs 濃度為0.2 mmol/L，引物稀釋為5 pmol，Taq DNA聚合酶為0.75 U。反應程序： 94℃下預變性3 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min， 30個循環；72℃延伸10 min。

4) PCR擴增產物的檢測。架好清洗干凈的制膠模板，將0.5 g瓊脂糖粉、50 mL 1×TAE緩沖液倒入干凈的三角瓶中，于微波爐中加熱使瓊脂糖融化，冷卻至45℃左右時加0.4 μL核酸染料(4℃)并搖晃混勻。慢慢倒入制膠模板中，不應有氣泡。放置20 min，待膠凝固后，將其取出并放入裝有1×TAE緩沖液的電泳槽中。用基因槍分別將5 μL PCR樣品、DNA Maker加入點樣孔中，于100 V電壓下電泳30 min。在凝膠成像系統下觀察500～700 bp的基因片段長度，將PCR產物送往測序公司測序。

5) 菌株比對鑒定。序列測定結果采用NCBI進行比對，得到同源性99%及以上的序列，再利用ClustalX1.83、BioEdit、Sequence Alignment Editor、PAUP、Tree View等軟件對所得序列進行分析，建造系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 根腐病病狀

滇重樓從染病部位開始根莖逐漸腐爛，但在發病早期滇重樓病癥表現不顯著，后期地上部分葉片因根部吸收水分及養分能力減弱，邊緣變黃焦枯，萎焉易拔起，最后整株萎蔫，根莖部腐爛變軟。白芨染病從塊莖處開始出現水漬狀腐爛，后塊根徹底變黑腐爛，地上部莖葉先表現葉尖枯黃葉片失綠，后出現大面積褐色枯斑枯死(圖1)。

圖1滇重樓(左)和白芨(右)根腐病地上部分癥狀

Fig.1 Aboveground symptom of root rot ofParispolyphyllavar.yunnanensis(left) andBletillastriata(right)

2.2 病原菌的形態特征及培養性狀

從圖2看出，分離菌(DB-R)菌體呈規則圓形，生長迅速，不易被污染，菌絲初期為白色絲狀，后變為紫紅色。

圖2 DB-R培養 3 d(左)和7 d(右)后的性狀

Fig.2 Morphological characteristics of DB-R after 3 days (left) and 7 days (right)

2.3 病原菌的分子鑒定

利用通用引物ITS1和ITS4擴增DB-R的rDNA-ITS序列，獲得500～750 bp長度的DNA片段(圖3)。將序列測定結果利用NCBI進行Blast比對，找到同源性達99%的序列(GenBank登錄號為MK156762)，在構建的系統發育樹中，DB-R與尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum(MK156762)相聚一群，且自舉值達100%(圖4)。因此，確定引起滇重樓和白芨根腐病的病原真菌為尖孢鐮刀菌。

注：M為2 000 bp的DNA Maker，1為菌株DB-R。

Note: M， 2 000 bp DNA Marker; 1,strain DB-R.

圖3菌株DB-R 的 rDNA-ITS基因序列 PCR產物電泳圖譜

Fig.3 Electrophoretograms for PCR products of rDNA-ITS gene sequences of DB-R strain

圖4基于 rDNA-ITS序列構建的菌株 DB-R系統發育樹

Fig.4 Phylogenetic tree of DB-R strain constructed based on rDNA-ITS sequences

3 結論與討論

尖孢鐮刀菌可危害茄科、豆科、林果及花卉等100多種植物，寄主范圍廣泛，種內含多個寄主專化型，在致病性上具有豐富的遺傳多樣性[11-12]。雖然試驗確定引起滇重樓和白芨根腐病的病原真菌是尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，但該菌株是否是滇重樓、白芨專化型還需通過與其他相關植物進行對比接種試驗。

傳統真菌學分類以形態學特征為主要依據，并遵循柯赫氏法則進行病原真菌的鑒定。但僅以病原真菌形態特征為分類依據，外界環境條件的影響很大，有時也很難獲得其有性無性孢子形態，甚至有些真菌不易或不形成繁殖器官，不僅不便于真菌的分類鑒定，而且不能充分反映出物種進化及種群間親緣關系。rDNA-ITS介于18SrDNA和28SrDNA之間， ITS在真菌種間變異豐富，但在同種內不同真菌間高度保守，可以提供豐富的遺傳信息，應用分子生物學方法鑒定真菌性病害已經成為一種重要手段[13-15]。研究結合傳統真菌形態學和rDNA-ITS序列分析，鑒定出危害滇重樓和白芨根腐病的病原真菌。參閱植物病原真菌學的相關研究[16-18]，不僅對DB-R的形態學特征進行了比對，而且在構建的基于rDNA-ITS序列的系統樹中，DB-R與尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum(MK156762) 自舉值達100%的聚在一起，確定引起滇重樓和白芨根腐病的病原真菌為能夠為尖孢鐮刀菌。

滇重樓和白芨都是土生土長的藥材，長期的自然選擇，使得其適應于該產地環境及植物的病原日益增多，而通過人工馴化后，植物的抗性往往降低，加之不當的栽培管理技術，使得種植區病害發生嚴重，甚至絕收。滇重樓及白芨的經濟價值主要為根部，尖刀鐮孢菌的危害不但能直接造成根部腐爛，還影響地上部的生長發育，間接地對其根部膨大成長產生影響，以此造成惡性循壞，導致絕收，嚴重阻礙當地藥材生產發展。對于滇重樓、白芨根腐病病原菌的確定，不但能夠幫助尋求滇重樓和白芨根腐病病害有效的防治方法，并為后續生防菌農藥制劑的生產及其他生物防治的選擇提供基礎資料，還為種植地的經濟發展做出貢獻。