干巴菌菌絲生物學特性及生長條件研究

張 琦， 王 航， 劉 琨， 王秋穎

(中國醫學科學院 北京協和醫學院藥用植物研究所， 北京 100193)

干巴菌(ThelephoraganbajunZang)在分類上隸屬于擔子菌門(Basidiomycota)、革菌目(Thelephorales)、革菌科(Thelephoraceae)、革菌屬(Thelephora)[1-2]。該菌主要分布于我國西南地區，是當地一種珍貴的食用真菌[3]。干巴菌營養豐富，含有粗蛋白、粗脂肪、總糖、灰分等營養元素，同時還含有16種氨基酸，多種微量元素、維生素以及其特有的具有很高營養保健價值的革菌酸[4-5]。干巴菌還具有重要的藥用價值，其含有的抗氧化物質對三苯化合物，能夠清除人體內的自由基，具有延緩衰老的功效[6-7]；含有的核苷酸、多糖等物質有助于降低膽固醇，其多糖還是醫藥方面最強的免疫劑與調節劑，雖然對癌細胞沒有直接的致死作用，但能刺激抗體形成，調節機體內部的防御功能，達到抗癌的作用[8]。干巴菌尚未實現人工養殖，目前市面上銷售的干巴菌均為野生資源[9]。該菌人工栽培困難的原因一是生長環境較為復雜，子實體中常常夾雜著大量雜菌和其他雜質，很難獲得純菌種，分離過程中污染嚴重[10]；二是干巴菌菌根營養方式復雜，脫離宿主植物不能獨立生存[11]。因此，實現干巴菌的人工栽培，還需要大量的實踐與研究。研究組在我國湖北成功分離得到干巴菌的菌絲，并對其進行生物學特性研究，以期為實現干巴菌的人工栽培提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種及其培養

菌種為2015年采自湖北宜昌野外的干巴菌子實體，并通過組織分離法獲得菌絲。

培養基為常規，配方：麥麩50 g(水煮0.5 h，3層紗布過濾，取濾液)，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。培養基經高壓滅菌30 min(0.12 ～0.15 MPa，121～126℃)后，取直徑為9 cm的培養皿20個，將15 mL培養基分別倒入培養皿中備用。將冰箱中保存的干巴菌菌種，經活化后在超凈工作臺上接種于有培養基的培養皿中，在黑暗室溫下(25℃)培養，待培養基長滿整個培養皿后，即可用于接種。

1.2 菌絲及菌落形態的觀察

在剛接種的干巴菌培養皿中，斜插入無菌的蓋玻片，在黑暗室溫下(25℃)培養；待菌絲長到蓋玻片一半時，觀察干巴菌菌絲的生長情況和菌落形態。

1.3 培養溫度、 pH和光照條件的篩選

培養溫度分別為18℃、22℃、26℃、30℃、32℃和34℃；培養pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0；光照為連續光照培養、連續黑暗培養和12 h/12 h光暗交替培養。

培養基為常規培養基，每個處理5次重復。采用平板培養法，取直徑9 cm的無菌培養皿，分別倒入已滅菌的各種培養基15 mL，待培養基完全凝固后，在超凈工作臺上將直徑8 mm的菌種塊接種于培養皿中部，不同溫度處理為黑暗條件下培養18 d，不同pH處理為室溫(25℃)黑暗條件下培養12 d，不同光照下培養為室溫下(25℃)培養12 d。每處理每天用游標卡尺測量并記錄菌絲生長速度，取5組測量的平均值，并觀察記錄菌落和菌絲生長狀態。

1.4 碳源、氮源、微量元素和維生素的篩選

1.4.1 碳源和氮源碳源分別為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉各20 g，以不加碳源的培養基為對照。除碳源外，還需添加大豆蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH保持自然。氮源分別為大豆蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨、胰蛋白胨、牛肉膏，每種各2 g,以不加氮源的培養基作對照。除氮源外，還需添加葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1.5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH保持自然。

以上培養基配制好后，經高壓滅菌鍋滅菌30 min(0.12～0.15 MPa，121～126℃，下同)后平板培養。取直徑9 cm的無菌培養皿，分別倒入已滅菌的各種培養基15 mL，待培養基完全凝固后，在超凈工作臺上將直徑8 mm的菌種塊，接種于培養皿中部，5次重復。接種后，分別于黑暗室溫(25℃)下培養13 d，觀察記錄菌落菌絲形態、生長勢和菌落顏色，用游標卡尺測量菌絲生長速度，并計算5次處理的平均值。

1.4.2 微量元素液體基礎培養基配方為葡萄糖20 g，大豆蛋白胨2 g，磷酸二氫鉀0.46 g，磷酸氫二鉀1 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。在液體基礎培養液中分別加入硫酸銅、硫酸鋅、硫酸錳和硫酸鎂各0.5 g，以不加微量元素的培養液為對照。將100 mL培養液加入250 mL三角瓶內，每個處理重復5次，經高壓滅菌冷卻后，在超凈工作臺上將直徑8 mm的菌種塊分別接入三角瓶內，于黑暗、恒溫(25℃)下搖床培養7 d。將培養7 d后的各處理菌絲分別用抽濾過濾，用蒸餾水洗滌菌絲體，于60℃烘干至恒重，取出分別稱量菌絲干重，記錄并計算5次處理的平均值。

1.4.3 維生素在液體基礎培養液中分別加入維生素B1和維生素B2，每種的量分別為100 mg/L，以不加維生素的培養液為對照。將100 mL培養液加入250 mL三角瓶內，每個處理重復5次，經高壓滅菌冷卻后，在超凈工作臺上將直徑8 mm的菌種塊分別接入三角瓶內，于黑暗、恒溫(25℃)下搖床培養7 d。將培養7 d后的各處理菌絲分別用抽濾過濾，用蒸餾水洗滌菌絲體，并于60℃烘干至恒重，取出分別稱量菌絲干重，記錄并計算5次處理的平均值。

1.5 數據處理

用軟件IBM SPSS Statistics V21.0進行數據處理和分析，用軟件GraphPad Prism 5.0作圖。

2 結果與分析

2.1 菌絲及菌落形態

顯微觀察顯示，干巴菌人工培養的菌絲分枝較多，有膈膜，無鎖狀聯合，未觀察到無性孢子(圖1)。

干巴菌菌絲形成的菌落較為濃密，絨毛短且略有毛氈狀；生長初期(0～5 d)，菌絲為純白色短絨毛狀，細密，粗壯；生長中期(6～10 d)菌絲開始出現黃褐色圓環，并且黃褐色圓環上菌絲數量明顯減少；生長后期(>10 d)菌絲為白色-黃褐色圓環交替出現，并且在菌落底部產生一些黑色代謝物。

圖1干巴菌的菌絲形態

2.2 不同環境條件下干巴菌菌絲的生長情況

2.2.1 溫度由表1可知，干巴菌菌絲在18～30℃均能生長，但是不同溫度對干巴菌菌絲生長的影響不同。培養溫度為18℃時，菌絲生長速度較慢，為(2.49±0.14)mm/d；隨著培養溫度的升高，菌絲生長的速度逐漸加快，生長勢也逐漸增強；溫度為30℃時，菌絲的生長速度最快，為(3.93±0.06)mm/d；當溫度高于30℃時，菌絲生長速度下降，溫度達32℃時，菌絲不生長。培養溫度為18℃與其他培養溫度之間差異極顯著。適合干巴菌菌絲生長的溫度為22～30℃。

表1不同溫度下干巴菌菌絲的生長情況

Table 1 Growth situation of mycelium ofT.ganbajunZang at different temperature

溫度/℃Temperature生長速度/(mm/d)Growth rate生長勢Growth vigor18 2.49 ± 0.14 aA+22 3.66 ± 0.14 bB++263.62 ± 0.13 bB++303.93 ± 0.06 bB+++320-340-

2.2.2 pH由圖2和圖3可見，干巴菌菌絲在pH 4.5～12.0均可生長，但略有差異。當pH<4.5時培養基過酸而不能凝固，但干巴菌菌絲依依然能生長；當pH在6.0～8.0時，菌絲生長較快，菌落顏色大部分為黃褐色和白色相間，菌落菌絲生長勢旺盛且生長濃密，菌絲生長速度間的差異不顯著； pH為9.0時，雖然菌絲生長速度仍較快，但是菌落菌絲長勢較差；pH>9.0時，干巴菌菌絲生長速度逐漸變慢，菌絲菌落密度和菌絲生長勢也減弱，氣生菌絲極為稀薄；pH為12.0時，菌絲生長速度僅為(0.96± 0.38)mm/d，與其余pH下的菌絲生長速度差異顯著。干巴菌菌絲對pH值適應范圍較廣，菌絲最適生長pH為6.0～8.0。

圖2 不同 pH培養條件下干巴菌菌絲的菌落形態

圖3不同 pH干巴菌菌絲的生長速度

Fig.3 Growth rate ofT.ganbajunZang at different pH culture conditions

2.2.3 光照由圖4可見，不同光照條件對干巴菌菌絲生長的影響存在顯著差異，干巴菌菌絲在連續黑暗條件下培養，菌絲的平均生長速度為(3.50± 0.29) mm/d，菌落菌絲生長勢旺盛，氣生菌絲發達，菌落菌絲濃密，淺黃色和白色相間；12 h/12 h光暗交替培養條件下，菌絲的平均生長速度為(3.14± 0.29) mm/d，菌絲有明顯的同心環紋，顏色為深黃褐色和白色相間，菌落菌絲生長勢較為旺盛，但是菌絲易老化；連續光照的培養條件下，雖然菌絲生長的平均速度高達(4.49± 0.10) mm/d，但是氣生菌絲極不發達，菌落菌絲稀疏，平貼在培養基表面。連續黑暗培養和12 h/12 h光暗交替培養條件下的菌絲生長速度無顯著性差異，但均與連續光照培養的菌絲生長速度存在顯著性差異。綜合菌絲平均生長速度和菌絲生長勢，連續黑暗培養是干巴菌菌絲的最佳培養條件。

圖4不同光照培養條件下干巴菌的菌落形態

2.3 不同營養條件下干巴菌菌絲的生長情況

2.3.1 碳源由圖5及表2可見，干巴菌在5種碳源和未加碳源的培養基中均能生長，但是不同碳源對干巴菌生長影響存在差異。可溶性淀粉和乳糖為碳源時，平均生長速度分別達(3.82±0.35)mm/d和(3.80±0.24)mm/d，同時菌落菌絲生長旺盛，菌絲濃密；其次為蔗糖、葡萄糖、麥芽糖作為碳源的處理，菌落菌絲濃密，生長勢旺盛；麥芽糖為碳源時效果最差，菌絲的平均生長速度僅(2.70±0.33)mm/d。培養基中無碳源時，干巴菌依然能生長且生長速度最快，達(4.06±0.17)mm/d，但是氣生菌絲長勢不旺盛，菌落菌絲微稀疏，平貼在培養基表面；除葡萄糖和麥芽糖處理下的菌絲生長速度和無碳源處理的菌絲生長速度存在顯著差異外，其余均無明顯差異。從菌絲生長平均速度和生長勢綜合評價，可溶性淀粉、乳糖為干巴菌生長的最適碳源。

圖5 添加不同碳源干巴菌的菌落形態

表2 添加不同碳源干巴菌的菌絲生長情況

2.3.2 氮源由圖6可知，干巴菌在硫酸銨作為氮源時不能生長，在其他培養基上均能生長。由表3可見，不同氮源對干巴菌生長影響存在差異。胰蛋白胨作為氮源時菌絲生長速度最快，可達(4.12 ± 0.17) mm/d，其次為硝酸鉀、牛肉膏、大豆蛋白胨；硝酸銨為氮源時，菌絲生長效果最差，不僅未生長，還發生了萎縮，可能由于硫酸銨中含有兩分子的氮元素，導致培養基中氮元素含量過大，反而抑制了干巴菌菌絲的生長。硝酸鉀和胰蛋白胨作為氮源時，菌落菌絲生長勢旺盛且濃密；大豆蛋白胨和牛肉膏為氮源時菌落菌絲較為濃密，生長勢較為旺盛；無氮源時雖然菌絲有所生長，但是氣生菌絲極為稀薄，幾乎為透明，可見氮源是干巴菌菌絲生長所必須的營養元素。大豆蛋白胨作為氮源和無氮源處理時，與胰蛋白胨作為氮源處理時的菌絲平均生長速度存在顯著性差異，其余處理無明顯差異。干巴菌不僅能較好利用有機氮，也能利用無機氮，除硫酸銨外的氮源，均對干巴菌的生長具有促進作用。

圖6添加不同氮源干巴菌的菌落形態

表3 添加不同氮源干巴菌的菌絲生長情況

2.3.3 微量元素 由表4可以看出，不同微量元素對干巴菌菌絲生長及干重影響不同。以硫酸鎂作為微量元素時菌絲生長速度最快，菌絲干重最重，達(243.8± 42.6)mg/100mL；其次為硫酸錳和硫酸鋅，兩者對菌絲的生長均有促進作用，菌絲干重明顯高于未添加微量元素的處理；硫酸銅作為微量元素處理的效果最差，對菌絲的生長有抑制作用，菌絲未生長。

2.3.4 維生素 表5可知，干巴菌在2種維生素和未添加維生素的培養液中均能生長。添加維生素B2的菌絲生長速度較快，菌絲干重最重，達(375.2±33.4)mg/100mL；添加維生素B1的培養液中菌絲長勢較差。添加維生素B2對干巴菌生長有促進效果，維生素B1略起抑制作用。

表4 添加不同微量元素干巴菌的菌絲生長情況

表5 添加不同維生素干巴菌的菌絲生長情況

3 結論與討論

研究結果表明，干巴菌菌絲在平板培養時，最適合的碳源是可溶性淀粉和乳糖，最適合的氮源是胰蛋白胨，pH6.0～8.0，溫度22～30℃，黑暗條件下培養，干巴菌落菌絲最濃密，生長最旺盛。在發酵培養的條件下，微量元素鎂對干巴菌菌絲生長最有利，維生素B2對促進干巴菌菌絲生長有顯著效果。試驗結果為目前野生資源短缺，并且不能進行人工栽培的干巴菌實現人工栽培及開發利用提供了理論依據。

一般食藥用真菌菌絲的最適生長溫度在25 ～28℃，所以在溫度試驗中選擇的溫度范圍為18～34℃，但試驗未篩選出最佳溫度，還有待作進一步試驗。但值得一提的是，在探究微量元素和維生素對干巴菌菌絲生長影響的研究中，三角瓶大小不同，菌落菌絲生長的速度和長勢也不盡相同，在不加任何微量元素和維生素，且接種量和所加培養基一致的情況下，200 mL三角瓶內的干巴菌菌絲干重明顯高于250 mL三角瓶內干巴菌菌絲干重，造成這一現象的原因尚有待進一步考證與探究。