結直腸癌患者血清 MMP-9、TIMP-1、E-cadherin 水平與臨床特征及預后的關系研究

武鴻彪 袁旦平 曹躍鵬 龐洪雙 劉東方 傅超 陶勇

結直腸癌是目前臨床最常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內發病率居惡性腫瘤第3位，且死亡率逐年上升[1]。近年來，盡管結直腸癌的手術方式、放化療及靶向藥物治療等研究均取得了較大進展，但患者預后依然欠佳。因此，進一步分析影響結直腸癌患者預后的相關因素，尋找有助于臨床診治的指標、標志物或新靶點是目前臨床研究的熱點與難點[2]。結直腸癌的發生、侵襲、轉移涉及基因突變、內環境改變、細胞信號通路異常、免疫系統失調等多個復雜的病理生理過程，相應血清標志物亦能監測其變化[3]。基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）屬于基質金屬蛋白酶（MMP）家族成員，在腫瘤發生、發展過程中可促使腫瘤細胞沿基底膜向周圍組織浸潤，加速腫瘤形成或擴散[4]。同時基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）為組織金屬蛋白酶抑制劑家族的一員，由巨噬細胞、成纖維細胞、內皮細胞、上皮細胞合成，可通過與活化的MMP-9或與MMP-9潛酶結合等方式，阻斷其過度活化，是MMP-9的天然抑制劑[5]。鈣黏附蛋白E（E-cadherin）參與降低腫瘤細胞間的粘連，促進腫瘤轉移。基于此，本研究采用ELISA法檢測結直腸癌患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin 水平，分析其與患者臨床特征及預后的關系，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2010年1月至2013年1月本院肛腸外科收治的行手術切除治療并經病理學檢查證實結直腸癌患者102例。其中男71例，女31例；年齡45～80（62.11±14.27）歲；結腸癌70例，直腸癌32例。患者術后按照美國癌癥聯合委員會（AJCC）結直腸癌TNM分期，Ⅰ期14例，Ⅱ期29例，Ⅲ期39例，Ⅳ期20例。所有患者均排除心、肝、腎等重要器官疾病，無合并嚴重內科疾病，無其他部位原發腫瘤及轉移瘤。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平檢測 采集患者術前空腹靜脈血4 ml于專用血清采集管中，室溫靜置 1 h 后離心（4℃，1 600 g，10 min），吸取上清液于-80℃保存，使用前置于冰上溶解。MMP-9、TIMP-1及E-cadherin ELISA檢測試劑盒購自深圳晶美生物工程公司，按說明書指導加入標本稀釋液與定量標準品，樣品孔每孔加入50μl樣品稀釋液及50μl標本，然后分別加入50μl人抗MMP-9、TIMP-1及E-cadherin抗體。酶標儀（美國BioTech公司）檢測各孔標本吸光度值，繪制標準曲線，并計算各標本MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平。

1.2.2 臨床特征收集 記錄患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤分級、腫瘤TNM分期等臨床特征資料。

1.2.3 預后觀察 患者術后隨訪由專門的隨訪小組通過電話、信函及門診等方式進行，記錄患者腫瘤復發轉移和死亡時間，隨訪截止至2018年1月，觀察并記錄患者無復發生存情況與總生存情況。無復發生存時間是指手術之日起至第1次出現腫瘤局部或區域復發轉移、隨訪終止的時間；總生存時間是指手術之日起至患者死亡、隨訪終止的時間。

1.3 觀察指標 （1）觀察患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平預測預后的最佳截點：通過繪制ROC曲線計算患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平預測預后（隨訪5年生存或死亡）的最佳截點，并以此將患者分為高（≥截點）與低（＜截點）MMP-9組、TIMP-1組、E-cadherin組。（2）比較高MMP-9組與低MMP-9組、高TIMP-1組與低TIMP-1組、高E-cadherin組與低E-cadherin組患者臨床特征、無復發生存情況與總生存情況。（3）分析結直腸癌患者預后的影響因素。

1.4 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件；計數資料以頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，兩組患者生存率的比較采用log-rank檢驗；單因素與多因素分析采用Cox比例風險模型；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平預測預后的最佳截點 以隨訪5年患者是否生存為結果，繪制患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平預測預后的ROC曲線，見圖1-3。

圖1 結直腸癌患者血清MMP-9水平預測預后的ROC曲線

圖2 結直腸癌患者血清TIMP-1水平預測預后的ROC曲線

圖3 結直腸癌患者血清E-cadherin水平預測預后的ROC曲線

由圖 1-3可見，患者血清 MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平預測預后的 AUC分別為 0.677、0.714、0.654，根據AUC及相應約登指數計算出最佳截點分別為 190、145、73ng/ml。

2.2 高與低MMP-9組、TIMP-1組、E-cadherin組患者臨床特征比較 見表1。

表1 高與低MMP-9組、TIMP-1組、E-cadherin組患者臨床特征比較[例（%）]

由表1可見，高MMP-9組與低MMP-9組、高TIMP-1組與低TIMP-1組、高E-cadherin組與低E-cadherin組患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤位置比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），腫瘤TNM分期、腫瘤T期比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。高MMP-9組與低MMP-9組、高TIMP-1組與低TIMP-1組患者腫瘤N期比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.3 高與低MMP-9組、TIMP-1組、E-cadherin組患者無復發生存情況與總生存情況比較 見圖4-9。

圖4 高MMP-9組與低MMP-9組患者無復發生存曲線比較

圖5 高MMP-9組與低MMP-9組患者總生存曲線比較

圖6 高TIMP-1組與低TIMP-1組患者無復發生存曲線比較

圖7 高TIMP-1組與低TIMP-1組患者總生存曲線比較

圖8 高E-cadherin組與低E-cadherin組患者無復發生存曲線比較

圖9 高E-cadherin組與低E-cadherin組患者總生存曲線比較

由圖4-9可見，患者隨訪15～60（中位數43）個月，其中失訪6例（其中包括非腫瘤相關死亡）。高MMP-9組與低MMP-9組、高TIMP-1組與低TIMP-1組、高E-cadherin組與低E-cadherin組患者5年無復發生存率分別為24.49%與61.61%、22.53%與61.16%、19.09%與25.31%，5年總生存率分別為24.24%與59.73%、17.69%與50.17%、51.87%與25.91%。高MMP-9組患者5年無復發生存率與5年總生存率均低于低MMP-9組患者（均P＜0.05）。高TIMP-1組患者5年無復發生存率與5年總生存率均低于低TIMP-1組患者（均P＜0.05）。高E-cadherin組患者5年總生存率高于低E-cadherin組（P＜0.05），高E-cadherin組與低E-cadherin組患者5年無復發生存率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 結直腸癌患者預后的影響因素分析 以隨訪5年患者是否無復發生存、是否生存為結果，分析影響結直腸癌患者預后的因素 見表2、3。

由表2、3可見，結直腸癌患者腫瘤TNM分期晚、淋巴結轉移陽性及高TIMP-1水平均是影響患者無復發生存和總生存預后的獨立危險因素（均P＜0.05）。

3 討論

惡性腫瘤的浸潤、轉移是其主要生物學特征，影響患者治療效果和預后。浸潤、轉移是一個復雜、多步驟的腫瘤細胞與機體間互相作用的連續過程。有學者提出了腫瘤細胞浸潤、轉移機制的三步學說，即黏附、降解和移動，不僅從理論上闡明了浸潤的可能步驟，而且涉及腫瘤細胞穿過細胞外基質屏障、基底膜、血管壁及穿出血管壁進入機體微環境的過程[6]。MMP系統、黏附分子及其它生物因子對此過程起重要調控作用，已成為目前臨床腫瘤轉移機制研究的熱點之一。研究發現，上皮細胞來源的腫瘤細胞與正常細胞之間存在某種特殊聯系機制。Patil等[7]研究非轉化上皮細胞和轉化癌細胞的共培養系統，發現癌細胞分泌MMP-9，剪切細胞原癌基因蛋白E-cadherin，進而證實癌細胞可誘導腫瘤上皮-間質轉化。同時，MMP可通過降解細胞外基質成分，調節血管生成和上皮-間質轉化，參與腫瘤細胞轉移過程。TIMP-1通過與作為重要調節劑的MMP結合起作用，并且可以抑制MMP的蛋白水解活性[8]。這種平衡遭到打破可能導致早期腫瘤發展、轉移。本研究通過檢測結直腸癌患者血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平，旨在分析其與患者臨床特征及預后的關系。

表2 結直腸癌患者無復發生存預后的影響因素分析

表3 結直腸癌患者總生存預后的影響因素分析

有文獻指出，在乳腺癌、胰腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中，MMP-9呈高表達，其具有降解蛋白聚糖、層粘連蛋白等的作用[9]。本研究從臨床表型入手，以更大的樣本量通過ELISA法分析血清MMP-9水平，結果顯示在結直腸癌患者中呈高表達，與上述研究結果一致。MMP-9參與惡性腫瘤發生、發展的機制主要包括以下幾個方面：破壞基質降解平衡，誘導腫瘤細胞穿過細胞外基質等構成的屏障，重整細胞之間的黏附關系并向周圍組織浸潤、侵襲，與血管內皮生長因子發揮協同作用，促使新生血管生成[10]。一項Meta分析顯示，伴淋巴結轉移陽性及高TNM分期的結直腸癌患者血清MMP-9存在高表達水平，進一步說明其可通過降解細胞外基質，促進結直腸腫瘤細胞向腸壁深層浸潤、發生淋巴結轉移及侵襲[11]。本研究結果顯示，血清MMP-9水平與腫瘤自身屬性比如腫瘤分期、浸潤深度及淋巴結轉移陽性等有關。生存分析發現，不同血清MMP-9水平患者5年無復發生存率與總生存率均存在差異，提示MMP-9具有較好的臨床預測預后價值。也有學者研究發現，與無肝轉移的結直腸患者相比，結直腸癌伴肝轉移的患者血清MMP-9水平明顯升高[12]。

TIMP是一組抑制MMP活性的低分子量蛋白，尤其是TIMP-1，可通過活化的間質膠質酶、活化的間質溶解素和 MMP-9以1∶1非共價鍵形成復合物，在腫瘤的浸潤和轉移過程中起抗浸潤和抗轉移的作用[13]。腫瘤惡變時MMP-9增高，反應性地調節升高TIMP-1，提示腫瘤生長、浸潤不單需要降解周圍基質，而且還需要依靠MMP-9/TIMP-1系統重建微環境和調節微血管形成[14]。TIMP-1可抑制腫瘤組織的血管生成，有效地抑制腫瘤的生長和轉移[15]。TIMP-1與MMP-9系統失衡會直接影響腫瘤的發展、侵襲、預后。本研究結果顯示血清TIMP-1水平與TNM分期、淋巴結轉移及浸潤深度有關，說明TIMP-1參與結直腸癌的發生、發展。多因素分析顯示，TIMP-1、腫瘤分期及淋巴結轉移陽性是結直腸癌患者預后不良的獨立危險因素。換而言之，結直腸癌患者血清TIMP-1水平升高可能提示患者預后不良。

除此之外，本研究也探討了E-cadherin在結直腸癌患者中表達水平與預后的關系。研究發現E-cadherin是一個抑癌基因，其功能異常與許多腫瘤的發生、發展有關[16]。Palaghia等[17]通過對結直腸腫瘤的研究發現，隨著腫瘤細胞分化程度的降低、腫瘤直徑的增大、浸潤深度加深、淋巴結轉移及腫瘤分期進展，E-cadherin的陽性表達率會隨之降低。E-cadherin表達缺失并可轉變為神經組織鈣黏蛋白N-cadherin，而后者的重新表達被視為結直腸癌中上皮間質轉化的明確特征[18]。N-cadherin還與間質成纖維細胞、內皮細胞和神經細胞相互作用，利于腫瘤細胞浸潤和轉移[19]。本研究結果顯示，血清E-cadherin水平與腫瘤分期及浸潤深度密切有關，而多因素分析顯示E-cadherin并非是預后的獨立危險因素，E-cadherin水平與結直腸癌患者5年總生存率有關。因此，通過檢測血清E-cadherin水平，及時對預后較差的結直腸癌患者進行有效的治療，可延長患者的生存期。

綜上所述，血清MMP-9、TIMP-1、E-cadherin水平對結直腸癌患者預后有良好的預測價值，高血清MMP-9、TIMP-1及低E-cadherin水平患者提示預后不良。