基于TCGA數(shù)據(jù)庫和免疫組化法對整合素β4與肺腺癌的關系研究

徐建峰 沈建飛 朱成楚

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]，在我國國民癌癥相關死亡中位居首位[2]。肺癌的組織學分型主要包括鱗癌、腺癌和大細胞癌，其中肺腺癌是女性、亞洲人種和非吸煙患者中最為常見的組織學分型[3]，患者預后大多較差[4]。以往臨床對肺腺癌的治療以手術和放化療為主。目前，靶向藥物應用的推廣給肺腺癌患者帶來新的希望[5-6]。隨著對人類基因表達譜的深入研究，通過靶向調(diào)控基因來實現(xiàn)肺腺癌精準治療[7]，以及通過檢測基因表達篩選肺腺癌患者和預測肺腺癌患者預后成為了可能[8-9]。

整合素是由α和β亞基形成的二聚體，人類基因組包括18個α亞基和8個β亞基，通過不同的組合可形成24種不同類型的整合素[10]。其中，整合素α6β4在細胞黏附過程中被認為尤為重要[11]。整合素α6亞基可通過與β1和β4亞基結(jié)合形成整合素α6β1和α6β4，而β4亞基僅能與α6亞基結(jié)合，這意味著β4亞基代表了整合素 α6β4的表達水平[10]，即整合素 α6β4可用整合素β4表示。作為一種跨膜受體，整合素是細胞與外環(huán)境之間交流的紐帶，同時參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10,12]。當腫瘤發(fā)生時，整合素會改變自身與細胞外基質(zhì)的親和力[13]。文獻顯示，整合素 β4 與乳腺癌[14]、膀胱癌[15]、宮頸癌[16]、頭頸部癌[17]等多種腫瘤關系密切，并在多種腫瘤組織中表達上調(diào)，被證實可與脂質(zhì)體中的表皮生長因子受體相互作用從而促進細胞的生長和增殖[14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，整合素β4在非小細胞肺癌，包括肺腺癌中存在過度表達，但在小細胞癌中未被檢測到[18]。

基于此，本研究通過分析TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者的臨床資料和mRNA表達數(shù)據(jù)，研究整合素β4基因在肺腺癌組織與癌旁正常組織中的表達，和對肺腺癌患者預后的影響；并通過免疫組化的方法，對來自浙江省臺州醫(yī)院的20例肺腺癌患者的肺腺癌組織與相應癌旁正常組織中的整合素β4蛋白進行檢測和分析，驗證整合素β4對肺腺癌患者的影響，以期為整合素β4成為治療肺腺癌的靶基因提供依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 肺腺癌組織芯片購自上海奧特多生物技術公司。整合素β4一抗和二抗均購自美國Abcam公司。二甲苯、乙醇購自浙江三鷹化學試劑有限公司。檸檬酸鹽、PBS、過氧化氫購自福州市邁新生物技術開發(fā)有限公司。DAB顯色液、蘇木素染色液購自上海碧云天生物技術有限公司。FBS購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 TCGA數(shù)據(jù)檢索 從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://cancergenome.nih.gov/）下載肺腺癌高通量基因測序數(shù)據(jù)（HTSeq-Count）和臨床數(shù)據(jù)集，共檢索到513例肺腺癌組織和59例正常癌旁組織的mRNA表達數(shù)據(jù)，以及513例肺腺癌患者的臨床資料，并將其納入本研究。所有整合素β4 mRNA表達數(shù)據(jù)采用log2進行標準化處理，所有數(shù)據(jù)均來自有效信息，不包括遺失的數(shù)據(jù)。

1.2.2 患者與標本 本研究所用的標本為2010至2018年浙江省臺州醫(yī)院收治的病理學檢查確診為肺腺癌的患者組織標本，組織標本由中心實驗室規(guī)范保存，共20例肺腺癌組織和相應癌旁正常組織納入本研究。本研究所有組織標本的取得均經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準與患者的知情同意。

1.2.3 整合素β4蛋白表達檢測 采用免疫組化法對肺腺癌組織和癌旁正常組織標本進行免疫染色。用二甲苯和超純水脫蠟，將組織放入檸檬酸鹽緩沖液，并放置于微波爐中加熱處理至沸騰；間斷加熱4～6次，保持亞沸騰溫度10min，隨后置于室內(nèi)中冷卻30min；用3%過氧化氫封閉10min，加入10%FBS封閉1h；將組織依次置于整合素β4（1∶100）抗體和稀釋的二抗中，在室溫下分別孵育2～3h和1h；用DAB顯色，蘇木素染核，再用鹽酸酒精分色，二甲苯脫水后拍取整合素β4染色結(jié)果圖片，用IPP軟件進行灰度值分析。整合素β4蛋白相對表達水平=灰度值（標本）/1 000。最后用Graphpad軟件處理數(shù)據(jù)和圖形。

1.3 觀察指標 （1）比較TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者癌組織與癌旁正常組織整合素β4 mRNA表達水平；（2）比較TCGA數(shù)據(jù)庫中不同臨床特征的肺腺癌患者癌組織整合素β4 mRNA表達水平；（3）比較肺腺癌患者癌組織與癌旁正常組織整合素β4蛋白表達水平；（4）比較不同臨床特征的肺腺癌患者癌組織整合素β4蛋白表達水平；（5）比較TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌組織整合素β4 mRNA高表達與低表達患者生存情況；（6）比較肺腺癌組織整合素β4蛋白高表達與低表達患者生存情況。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗或配對t檢驗；生存分析的最佳截斷值來自X-tile軟件[19]分析結(jié)果；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者癌組織與癌旁正常組織整合素β4 mRNA表達水平比較 見表1。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌患者癌組織與癌旁正常組織整合素β4 mRNA表達水平比較

由表1可見，整合素β4 mRNA在肺腺癌組織的表達水平高于在癌旁正常組織的表達水平，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 TCGA數(shù)據(jù)庫中不同臨床特征的肺腺癌患者癌組織整合素β4 mRNA表達水平比較 見表2。

表2 TCGA數(shù)據(jù)庫中不同臨床特征的肺腺癌患者癌組織整合素β4 mRNA表達水平比較

由表2可見，不同性別、年齡、種族、腫瘤位置、M分期、T分期、N分期、腫瘤分級的肺腺癌患者癌組織整合素β4 mRNA表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.3 肺腺癌患者癌組織與癌旁正常組織整合素β4蛋白表達水平比較 見圖1（插頁）、表3。

表3 肺腺癌患者癌組織與癌旁正常組織整合素β4蛋白表達水平比較

由圖1、表3可見，整合素β4蛋白在肺腺癌組織的表達水平高于在癌旁正常組織的表達水平，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4 不同臨床特征的肺腺癌患者癌組織整合素β4蛋白表達水平比較 見表4。

表4 不同臨床特征的肺腺癌患者癌組織整合素β4蛋白表達水平比較

由表4可見，整合素β4蛋白在T2～3期肺腺癌患者癌組織中的表達水平高于在T1期肺腺癌患者癌組織中的表達水平，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同性別、年齡、種族、腫瘤位置、N分期的肺腺癌患者癌組織整合素β4蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

2.5 TCGA數(shù)據(jù)庫中肺腺癌組織整合素β4 mRNA高表達與低表達患者生存情況比較 X-tile軟件顯示進行生存分析時整合素β4 mRNA表達水平的最佳截斷值為14.12，整合素β4 mRNA高表達（≥14.12）與低表達（＜14.12）患者生存曲線比較見圖2。

圖2 肺腺癌組織整合素β4 mRNA高表達與低表達患者生存曲線比較

由圖2可見，肺腺癌組織整合素β4 mRNA高表達與低表達患者5年生存率分別為22.4%、44.1%，高表達患者5年生存率明顯低于低表達患者（P＜0.05）。

2.6 肺腺癌組織整合素β4蛋白高表達與低表達患者生存情況比較 X-tile軟件顯示進行生存分析時整合素β4蛋白表達水平的最佳截斷值為7.74，肺腺癌組織整合素β4蛋白高表達（≥7.74）與低表達（＜7.74）患者生存曲線比較見圖3。

圖3 肺腺癌組織整合素β4蛋白高表達與低表達患者生存曲線比較

由圖3可見，肺腺癌組織整合素β4蛋白高表達與低表達患者5年生存率分別為25.0%、57.1%，高表達患者5年生存率明顯低于低表達患者（P＜0.05）。

3 討論

肺腺癌是一種臨床常見的惡性腫瘤，患者預后往往不佳，探尋新的靶向基因治療方法意義重大。本研究中，筆者探討了整合素β4 mRNA和蛋白表達水平與肺腺癌發(fā)生、發(fā)展和預后之間的關系。

本研究結(jié)果顯示，與肺腺癌患者的癌旁正常組織相比，肺腺癌組織中整合素β4 mRNA和蛋白表達水平均明顯上調(diào)。同時，本研究還顯示整合素β4與肺腺癌進展有關。肺腺癌組織中整合素β4蛋白表達水平在T分期較高的患者中明顯上調(diào)，雖然在TCGA數(shù)據(jù)庫中，整合素β4 mRNA表達水平與T分期之間無明顯關系，但是可以看出T3分期的肺腺癌患者癌組織中整合素β4 mRNA表達水平高于T1分期患者，兩者單獨比較差異有統(tǒng)計學意義。這些結(jié)論均支持整合素β4與肺腺癌進展密切相關的觀點。

事實上，過去Stewart等[20]研究已經(jīng)表明，相比于癌旁正常組織，整合素β4在肺腺癌組織中表達上調(diào)，且與靜脈侵犯存在一定的相關性，并降低了非小細胞肺癌（包括腺癌和鱗狀細胞癌）患者的總體生存率。另一方面，已有的文獻表明，整合素β4在多種腫瘤組織中表達上調(diào)，如膀胱癌、宮頸癌、肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌和乳腺癌等。同時在乳腺癌、胰腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌等腫瘤患者中，癌組織中整合素β4高表達的患者預后較差[10]。綜合以上研究與本研究結(jié)果，筆者認為整合素β4的上調(diào)可能與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預后有關。本研究分別從基因和蛋白水平進行驗證，且所選的研究組織標本均來自臨床患者，因此分析的結(jié)論更加具備可靠性，當然另一方面，樣本量仍需進一步擴大，并且整合素β4在肺腺癌中的作用機制也需通過動物和細胞實驗去驗證。綜上所述，整合素β4在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。整合素β4在肺腺癌組織中表達上調(diào)，且整合素β4高表達的患者預后較差。整合素β4或可作為治療肺腺癌患者新的潛在靶點和預后指標。