丙泊酚對斑馬魚胚胎運動神經元發育的影響

曹建斌 朱敏淑 曹東航 王明倉 李軍

丙泊酚是一種廣泛使用的麻醉藥，它具有起效快、代謝迅速，使用后患者蘇醒平穩、不良反應少等優點，常用于嬰幼兒手術的麻醉。和其他常用的臨床麻醉藥一樣，丙泊酚的早期多次接觸會增加患兒術后多動癥、語言障礙、注意力缺陷和行為異常等風險[1-2]；這些不良反應癥狀中，很多可能涉及到運動神經元功能的障礙。盡管丙泊酚對運動神經元發育的影響尚未見報道，其潛在的風險并不能忽視。所以，有必要設計和開展嚴密的科學實驗評估丙泊酚對運動神經元發育的影響，以便于指導臨床醫生對患兒合理使用麻醉藥。斑馬魚是一種常見的模式脊椎動物，它具有體外受精、胚胎透明、易于遺傳操作等特點，因此常被用來觀察胚胎發育，包括運動神經元發育[3]。斑馬魚的基因與人類的基因相似度很高，序列同源性高達87%[4]，所以斑馬魚也常用于臨床藥物研發與評估[5]。本研究利用標記運動神經元的Tg（hlxb9:mGFP）轉基因斑馬魚品系，在活體上觀察丙泊酚對斑馬魚胚胎運動神經元發育的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 轉基因斑馬魚為Tg（hlxb9:mGFP）品系，由中國科學院神經科學研究所提供。按照Kimmel胚胎分類方法[6]進行實驗。將Tg（hlxb9:mGFP）品系斑馬魚飼養在循環水養殖系統中，飼養間保持在14h∶10h的亮暗循環中。在實驗前1d 21：00將發育成熟的轉基因斑馬魚按雌雄1∶1放入交配缸中（每缸共2條），并用擋板隔開。實驗當日11：00拔去擋板，10min后收集胚胎，并將胚胎放入28.5℃恒溫培養箱中培養。實驗藥物為丙泊酚（中國費森尤斯卡比公司），二甲基亞砜（DMSO）、MS-222（美國Sigma-Aldrich公司）。

1.2 儀器 智能光照培養箱（多段編程GXZ型，中國寧波江南儀器廠），斑馬魚養殖系統（中國愛生公司），Nikon SMZ 1000顯微鏡（日本尼康公司），FV-1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 分組與藥物處理 當胚胎受精后8h（hpf），在顯微鏡下確定胚胎處于相同發育階段，選擇健康的受精卵轉入六孔板飼養，每孔放入30個胚胎并加入4ml魚房系統水。胚胎分為5組，并進行相應的藥物處理：A組用20μg/ml丙泊酚處理組，B組用10μg/ml丙泊酚處理組，C組用5μg/ml丙泊酚處理組，D組用DMSO溶劑處理作為對照，E組不作任何處理（空白對照組）。各組藥物處理時間從8hpf持續至52hpf，結束后用系統水洗脫藥物3次，然后從各組中隨機取12個胚胎進行觀察分析各組胚胎整體發育狀況，取胚胎整體發育正常組的胚胎進行熒光共聚焦成像。

1.4 活體成像觀察 將各組斑馬魚胚胎先予0.03%MS-222麻醉3min，然后用1.5%低熔點膠對各組斑馬魚胚胎進行側躺固定包埋，以便拍照。待包埋胚胎的膠凝固冷卻后，在胚胎上方滴上1滴系統水浸沒胚胎，然后用激光共聚焦顯微鏡進行拍照，觀察斑馬魚軀干泄殖孔前方8個體節區域運動神經元軸突生長情況，統計各組每條斑馬魚該節段未長出突起的運動神經元比例。按照斑馬魚運動神經元突起的缺失程度進行分類[3]，缺失比例＞80%為重度缺失，缺失比例＜20%為正常，其余為中度缺失。

1.5 統計學處理 采用GraphPad Prism v6.0統計軟件。正態分布的計量資料以表示，組間比較采用非配對雙尾t檢驗；計數資料采用頻率（百分率）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丙泊酚對斑馬魚整體發育的影響 結果表明，A組、B組斑馬魚胚胎形態停滯在原腸胚時期，說明該濃度的丙泊酚有明顯的胚胎毒性。發育正常的胚胎比例C組為（78.9±7.0）%，D 組為（84.4±5.1）%，E 組為（87.9±7.0）%，C組與D組、E組發育正常的胚胎比例比較均無統計學差異（均P＞0.05），說明5μg/ml丙泊酚處理不會對斑馬魚的整體發育狀況造成明顯的影響，因此，本研究可用這一藥物濃度處理的斑馬魚來評估丙泊酚對運動神經元發育的特異影響。

2.2 丙泊酚對運動神經元發育的影響 不同胚胎的運動神經元突起生長情況不盡相同，有的胚胎大多數運動神經元都長出突起，有的胚胎很少有運動神經元長出突起。運動神經元突起發育情況見圖1，與正常的運動神經元相比，部分神經元發育呈重度和中度缺失。對各組胚胎的運動神經元發育狀況進行分析歸納，結果表明，5μg/ml丙泊酚處理導致斑馬魚胚胎運動神經元發育畸形（重度缺失和中度缺失）的比例明顯增加（P＜0.01，表1），說明丙泊酚能夠影響運動神經元發育。

圖1 激光共聚焦顯微鏡運動神經元缺失程度圖（a：方框所示為本實驗工具所拍攝運動神經元節段；b：運動神經元發育重度缺失，×20；c：運動神經元發育中度缺失，×20；d：正常的運動神經元，×20）

表1 各組斑馬魚胚胎運動神經元缺失程度比較[個（%）]

3 討論

臨床回顧性研究發現，嬰幼兒早期接受全身麻醉和鎮靜，可導致神經系統功能障礙，包括學習能力下降、認知功能減低等。丙泊酚是目前最常用的全身靜脈麻醉藥，具有起效快、蘇醒迅速及蘇醒平穩等優點，廣泛應用于嬰幼兒全麻誘導和維持[7]。由于哺乳動物胚胎在子宮內發育，丙泊酚對活體胚胎期神經系統發育受到限制。斑馬魚因其胚胎體外受精及發育，通體透明、易于觀察等特點，突破上述限制，已廣泛應用于神經發育研究，成為研究胚胎期藥物神經毒性的首選模式動物。

近來眾多研究明確證實，丙泊酚可改變樹突棘形態和突觸結構來影響神經系統的發育，從而導致運動、學習等功能障礙[8-9]，而對運動神經元生長發育的影響尚未見報道。研究發現，丙泊酚的神經毒性在嚙齒類動物出生后7～14d最為敏感。而在神經干細胞的分化、遷移及增殖期間，丙泊酚是否能通過影響軸突的生長來影響神經元的發育尚未見報道，探討這一問題具有重要意義。本研究表明，丙泊酚處理影響斑馬魚胚胎運動神經元發育，表現為運動神經元未分化細胞增多，軸突不能投射到相應的肌肉。在本研究中，斑馬魚胚胎暴露于5μg/ml的丙泊酚中，胚胎整體發育與DMSO組及空白對照組相比無統計學差異；5μg/ml丙泊酚處理導致斑馬魚胚胎運動神經元發育畸形的比例明顯增加（P＜0.01）。因此，5μg/ml丙泊酚暴露對斑馬魚胚胎的整體發育影響與對照組相比無統計學差異，由于正常狀況下也有少部分胚胎出現重度缺失和中度缺失的情況，因此筆者推測丙泊酚的作用可能是延遲運動神經元突起的生長。

綜上所述，斑馬魚胚胎早期暴露于丙泊酚會引起運動神經元發育的缺陷。這表明丙泊酚作為常用的嬰幼兒臨床手術麻醉藥是存在影響嬰幼兒神經系統發育風險的。但運動神經元的發育是一個復雜且精密的過程，丙泊酚影響運動神經元發育的機制還有待深入的探索。