白花鬼針草提取液對小鼠急性酒精性肝損傷保護(hù)作用的研究

農(nóng)生斌 盧紅梅

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院,廣西百色 533000;2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530007)

白花鬼針草(Bidens Pilosa L.var.radiata)為菊科鬼針屬植物,具有清熱解毒、利濕退黃、散瘀活血的效用[1],我國民間上主要用于治療高血壓病、感冒發(fā)燒、中暑、消化不良、糖尿病等,還有用于治療跌打內(nèi)外傷、胃腸炎、急性黃疸型肝炎等疾病,研究表明,白花鬼針草乙醇乙酯提取物能顯著抗癌,抑制結(jié)腸癌RKO細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)其凋亡[2]。為探討白花鬼針草提取液對小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用,為白花鬼針草進(jìn)一步開發(fā)成為保肝護(hù)肝藥物提供理論依據(jù),筆者開展白花鬼針草提取液對小鼠急性酒精性肝損傷保護(hù)作用的研究,現(xiàn)報道如下。

1 材料與儀器

1.1 儀器

和試劑TDZ4A-WS型臺式低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);TGL-16G型臺式低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);PR0200型勻漿機(jī)(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)。G80D23CSL型微波爐;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、乙醇脫氫酶(ADH)及總超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(均購于南京建成生物工程研究所)。

1.2 藥品

白花鬼針草,經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)學(xué)教研室覃道光副教授鑒定為真品;56°紅星二鍋頭;海王金樽片。

1.3 實(shí)驗動物

昆明種SPF級健康雄性小鼠,體重18～22g,許可證編號：SYXK桂2011～0010,由右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心提供。

2 方法

2.1 白花鬼針草提取液的制備[5]

取適量白花鬼針草全草干品粉碎,按水料比4∶1浸泡40min,盛裝于1000ml玻璃燒杯中,加蓋微波處理5次,每次30s。微波處理后,用10倍的蒸餾水分2次浸提,每次30min,合并濾液,真空抽濾后濃縮約至每毫升白花鬼針草提取液含生藥1g,即1.0g/ml。冰箱冷藏備用。

2.2 小鼠最佳給酒量的篩選[6]

醉酒狀態(tài)的判斷以翻正反射是否消失為指標(biāo),小鼠灌酒后,將其背部向下輕放于平板上,若背向下的姿勢能夠保持30s以上則視為翻正反射消失,即為醉酒。取SPF級雄性小鼠50只,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將小鼠隨機(jī)分為5組,每組10只小鼠,并以0.12ml/10g、0.13 ml/10g、0.14ml/10g、0.15ml/10g、0.16ml/10g的灌酒劑量隨機(jī)給5組貼上標(biāo)簽,采用灌胃法給上述各組小鼠相應(yīng)劑量的紅星56°二鍋頭酒,統(tǒng)計各組醉酒例數(shù)和死亡情況,選擇致小鼠急性酒精中毒模型所需的最佳給酒量。

2.3 小鼠的分組及給藥[7]

取SPF級雄性小鼠84只,體重18～22g,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分成6個組,正常組、模型組、陽性組(海王金樽1g/ml)及白花鬼針草提取液低劑量、中劑量及高劑量組(分別為0.25g/ml、0.5g/ml及0.75g/ml),每組14只。各組小鼠均按0.1ml/10g的劑量灌胃給予相應(yīng)藥液。除正常組和模型組給予等體積生理鹽水外,其余各組分別給予相應(yīng)劑量藥液,每天1次,連續(xù)7d。末次給藥前禁食不禁水12h后灌胃給予藥液,30min后除正常組給予等體積生理鹽水外,其余各組均采用2.2.2中最佳給酒量一次性灌胃56°紅星二鍋頭酒。觀察小鼠醉酒潛伏期、醉酒率及死亡情況。

2.4 指標(biāo)檢測

于給酒6h后,摘眼球取血,以2500r/min離心15min分離血清備用;小鼠脫臼處死,迅速剖取肝臟,稱取肝濕重,取適量肝組織制備10%的組織勻漿,以3500r/min離心15min后取上清液;嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測ALT、AST、ADH、SOD、GSH和MDA各項指標(biāo)。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.00軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,各組實(shí)驗數(shù)據(jù)均以(±s)表示,各組間的比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠最佳給酒量的篩選

與其他劑量相比,灌胃0.14ml/10g劑量的56°紅星二鍋頭酒能夠得到理想的醉酒例數(shù),同時醉酒潛伏期較短且無死亡現(xiàn)象。故本實(shí)驗選用0.14ml/10g劑量進(jìn)行急性酒精中毒實(shí)驗的最佳給酒劑量(見表1)。

表1 小鼠最佳給酒量的選擇

3.2 對醉酒潛伏期、醉酒率、死亡情況的影響

與模型組相比,陽性組、白花鬼針草提取液低、中劑量組均能延長小鼠的醉酒潛伏期,提高小鼠對酒精的耐受能力(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05),但陽性組的效果更為明顯;白花鬼針草提取液高劑量組無明顯差異但也表現(xiàn)出延長潛伏期的趨勢,各組均無死亡例數(shù)(見表2)。

3.3 對血清AST、ALT的影響

與正常組相比,模型組的AST、ALT活性增高(P＜0.01,P＜0.05)。與模型組相比,陽性組的AST、ALT具有顯著性差異(P＜0.01,P＜0.01),白花鬼針草提取液低劑量的AST、ALT具有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.05)(見表3)。

表3 白花鬼針草提取液對急性酒精中毒小鼠血清AST、ALT的影響(±s)

表3 白花鬼針草提取液對急性酒精中毒小鼠血清AST、ALT的影響(±s)

注：與正常組相比,?為P＜0.05,??為P＜0.01;與模型組相比,#為P＜0.05,##為P＜0.01

組別 n ALT(U/L) AST(U/L)正常組 14 42.05±11.23 24.45±5.65模型組 14 52.80±14.42? 35.62±9.86??陽性組 14 40.85±9.02## 24.02±6.45##低劑量組 14 44.01±10.79# 28.07±7.55#中劑量組 14 47.10±10.32 29.99±8.97高劑量組 14 48.52±12.91 33.49±7.01

3.4 對肝組織ADH、GSH、SOD、MDA的影響

與正常組相比,模型組GSH含量、ADH、SOD活性均下降(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05),MDA水平升高(P＜0.05)。與模型組相比,陽性組的ADH、GSH、SOD及MDA具有顯著性差異(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01),白花鬼針草低、中劑量組的ADH具有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.05)白花鬼針草低劑量組的GSH具有顯著性差異(P＜0.05),白花鬼針草低、中及高劑量組的SOD具有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05),白花鬼針草低、中劑量組的MDA具有顯著性差異(P＜0.01,P＜0.05)。與陽性組相比,白花鬼針草中劑量組對肝組織中SOD活性的提高幾乎相當(dāng);白花鬼針草低劑量組對肝組織中MDA水平的降低優(yōu)于陽性組(見表4)。

表4 白花鬼針草提取液對急性酒精中毒小鼠肝組織ADH、GSH、SOD、MDA的影響(±s)

表4 白花鬼針草提取液對急性酒精中毒小鼠肝組織ADH、GSH、SOD、MDA的影響(±s)

注：與正常組相比,?為P＜0.05,??為P＜0.01;與模型組相比,#為P＜0.05,##為P＜0.01

組 別 n ADH(U/ml) GSH(mol/l) SOD(U/ml) MDA(mol/l)正常組 14 4.21±1.32 9.78±3.35 122.80±25.21 4.06±1.15模型組 14 2.89±0.53?? 5.06±1.80?? 104.32±19.38? 5.18±1.27?陽性組 14 4.38±1.20## 9.56±3.15## 129.54±22.46## 3.93±0.94##低劑量組 14 3.88±1.46# 8.51±4.96# 124.95±22.87# 3.97±1.29##中劑量組 14 3.76±1.34# 7.69±2.82 125.72±21.66## 4.12±1.07#高劑量組 14 2.99±0.71 6.73±3.72 121.09±14.45# 4.68±1.28

4 結(jié)果與討論

目前,對于保肝、防治急性酒精中毒的研究,西方國家以合成藥物為主,而東方國家以天然植物開發(fā)為主[8]。防治急性酒精中毒的機(jī)制主要是通過減少酒精吸收,降低血中酒精及相關(guān)代謝產(chǎn)物的濃度,減緩對臟器造成的損害[9]。本實(shí)驗中,陽性組、白花鬼針草提取液低、中劑量組均能延長小鼠的醉酒潛伏期(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05),結(jié)果表明三者能夠減少酒精的吸收,有效的提高小鼠對酒精的耐受能力,但白花鬼針草提取液的效果不如海王金樽的效果明顯。

AST和ALT是存在于肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)重要的轉(zhuǎn)氨酶,主要是用于檢測肝功能的常用指標(biāo),當(dāng)肝臟受到損傷出現(xiàn)炎癥反應(yīng)或者壞死時,肝細(xì)胞膜破裂后將轉(zhuǎn)氨酶釋放入血液,此時血液中的AST和ALT將會升高,其數(shù)值表示肝臟損害的程度[10,11]。本實(shí)驗中,模型組ALT、AST含量顯著增高,提示急性酒精中毒小鼠出現(xiàn)肝臟嚴(yán)重?fù)p傷的現(xiàn)象,表現(xiàn)為肝功能異常,而與陽性組的AST、ALT與模型組相比具有顯著性差異(P＜0.01,P＜0.01),提示陽性組能明顯降低血清AST、ALT的活性;白花鬼針草提取液低劑量的AST、ALT與模型組相比具有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.05),結(jié)果表明其能降低血清AST、ALT的活性,能夠?qū)辜毙跃凭卸舅碌母闻K嚴(yán)重?fù)p傷,減輕肝組織損傷所引起的炎癥反應(yīng)或壞死程度,具有一定的改善肝功能的作用;但與陽性組相比,海王金樽片的效果優(yōu)于白花鬼針草提取液低劑量組的效果。

肝組織內(nèi)存在乙醇脫氫酶(ADH),是機(jī)體內(nèi)主要參與酒精代謝的酶,吸收后在肝臟代謝的酒精經(jīng)ADH多次催化氧化后形成中間產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán),并以二氧化碳和水的形式排泄[12]。其中經(jīng)代謝所產(chǎn)生的部分中間產(chǎn)物可損傷肝細(xì)胞、影響三羧酸循環(huán)以及損傷組織再生修復(fù)[13]。因此,通過提高肝細(xì)胞內(nèi)ADH的活性,可加速酒精的代謝,減輕酒精及其代謝過程產(chǎn)生的中間產(chǎn)物對機(jī)體臟器所致的傷害。本實(shí)驗中,模型組ADH活性明顯下降(P＜0.01),陽性組、白花鬼針草提取液低、中劑量組ADH活性上升(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05),陽性組的效果更為明顯,結(jié)果表明在急性酒精中毒狀態(tài)下,白花鬼針草提取液能夠提高肝組織ADH的活性,加速酒精在體內(nèi)的代謝過程。

過量飲酒后酒精的吸收遠(yuǎn)大于代謝,大量吸收后的酒精經(jīng)過循環(huán)作用使得機(jī)體產(chǎn)生過多自由基,從而對臟器具有損傷的作用[14]。GSH是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑,具有整合解毒的作用,通過與自由基等有害物質(zhì)結(jié)合后轉(zhuǎn)化成無害物質(zhì)。SOD是生物體內(nèi)重要的酶自由基清除劑,直接反映機(jī)體抵抗氧化的水平,有效清除機(jī)體內(nèi)過量的自由基,MDA是活性氧自由基引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要生成物之一,它的含量能夠間接表現(xiàn)機(jī)體抗氧化能力及清除氧化生成物的能力[15,16]。因此,通過提高機(jī)體內(nèi)SOD活性和增加GSH含量,減少M(fèi)DA的水平,可以有效地減輕急性酒精中毒引起的臟器損害。本實(shí)驗中,陽性組和白花鬼針草低、中及高劑量組SOD活性升高(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01,P＜0.05),尤以陽性組、中劑量組較為顯著;陽性組、白花鬼針草低、中劑量組MDA含量下降(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05),以陽性組和低劑量組效果更佳;陽性組和白花鬼針草低劑量組GSH水平增加(P＜0.01,P＜0.05),結(jié)果表明白花鬼針草提取液能促進(jìn)急性酒精中毒小鼠清除自由基,增強(qiáng)抗氧化的能力,對急性酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

5 結(jié)論

白花鬼針草提取液對小鼠急性酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用,可能與提高小鼠對酒精的耐受能力、減輕酒精對肝組織損傷所引起的炎癥反應(yīng)或壞死程度、加快酒精在體內(nèi)的代謝速度、增強(qiáng)抗氧化能力和清除體內(nèi)自由基能力有關(guān);究竟是白花鬼針草提取液中的哪些有效成分在發(fā)揮作用,有待進(jìn)一步研究。