氯氰菊酯暴露對未成年小鼠大腦皮質及血清5-HT、DA和NE的影響

周禮華，劉函冰，陳韓磊

（蚌埠醫學院公共衛生學院，安徽 蚌埠 233000）

擬除蟲菊酯（pyrethroid）是人工合成的新型 農藥，因其具有高效性、低毒性及低環境持久性等特點廣泛應用于農業害蟲防治、家庭及公共場所中的衛生害蟲防治等方面。目前，擬除蟲菊酯類殺蟲劑的應用已超過全世界殺蟲劑的30%［1］。隨著使用量增加，毒性作用逐漸被重視。研究顯示，擬除蟲菊酯可造成哺乳類動物免疫系統、生殖系統、神經系統等多系統損害［2-4］，其中神經系統的毒性備受關注。腦發育過程中接觸農藥可能是神經退行性疾病發病的重要危險因素，未成年期暴露會使動物成年后再暴露時易感性增加，而擬除蟲菊酯暴露是帕金森病變的危險因素［5-7］。神經遞質是神經元間、神經元與靶細胞間發揮信號傳遞功能的化學物質。單胺類神經遞質包括5-羥色胺（serotonin，5-HT）、多巴胺（dopamine，DA）、去甲腎上腺素（noradrenaline，NE）等，單胺類神經遞質含量的異常影響著神經系統的正常功能，進而干擾機體運動、睡眠、情感等活動［8］。本研究選用Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑——氯氰菊酯（cypermethrin，CYP）作為代表，研究CYP對C57BL/6未成年小年鼠大腦皮質及血清中單胺類神經遞質的影響，探討CYP對神經系統的毒性機制，為規范擬除蟲菊酯類殺蟲劑合理應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6未成年小鼠18只，4周齡，性別不限，體重（12.39±1.28）g，由蚌埠醫學院實驗動物中心提供（許可證號：SCXK（蘇）2017-0001），飼養條件：溫度（24±2）℃，濕度40%～70%。

1.2 藥品與試劑 CYP標準品（美國Sigma公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物有限公司）；血清及大腦皮質5-HT、DA、NE酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組與染毒方法 將未成年小鼠隨機為：對照組、CYP 50 mg/kg及CYP 100 mg/kg暴露組，每組6只。實驗前各組小鼠體重差異無統計學意義（P＞0.05）。暴露組分別給予CYP 50 mg/kg及100 mg/kg腹腔注射（CYP用玉米油溶解），每日1次，連續4 d。對照組給予等體積生理鹽水代替。每日注射前稱取小鼠體重，同時，觀察實驗小鼠日常活動、情緒、攝食、飲水的變化。

1.3.2 小鼠血清制備及5-HT、DA、NE含量測定 小鼠經水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射麻醉后，摘除眼球取血，每只小鼠收集血液0.4 ml，EP管內室溫靜置2 h，然后2 000×g離心15 min，血清分離后置于-80℃冰箱儲存。嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟測定血清中5-HT、DA、NE的含量。

1.3.3 小鼠腦組織臟器系數分析 小鼠摘眼球取血后，立即將其斷頭處死，用剪刀依次剪開皮膚及顱骨，小心取出腦組織，準確稱量腦組織重量（以上操作在冰上進行），計算公式：小鼠臟器系數=腦組織重量（g）/小鼠體重（g）×100。

1.3.4 小鼠大腦皮質制備及5-HT、DA、NE含量測定 腦組織稱重后，仔細分離小鼠大腦皮質，然后用0.9%生理鹽水沖洗，濾紙吸干、稱重、剪碎，加入預冷生理鹽水（1∶9）制成10%的組織勻漿。將勻漿液5 000×g離心10 min后取上清。嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟測定大腦皮質單胺類神經遞質5-HT、DA、NE含量。樣品蛋白濃度測定采用BCA法。

1.4 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料采用均數±標準差表示，組間比較采用方差分析及LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠一般情況觀察及腦的臟器系數測定 實驗期間，對照組小鼠活動如常；暴露組小鼠精神萎靡，體毛蓬亂，眼角周圍有不同程度分泌物殘留。CYP暴露組小鼠腦臟器系數高于對照組，其中CYP 100 mg/kg暴露組臟器系數與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 CYP暴露對未成年小鼠臟器系數的影響

2.2 CYP對小鼠大腦皮質5-HT、DA及NE的影響 CYP 50 mg/kg及100 mg/kg暴露組小鼠大腦皮質5-HT、DA含量均低于對照組（P＜0.05），CYP 100 mg/kg暴露組DA含量低于CYP 50 mg/kg暴露組（P＜0.05）；CYP暴露組與對照組NE含量比較差異無統計學意義。見表2。

表2 未成年小鼠大腦皮質5-HT、DA、NE含量比較

2.3 CYP對小鼠血清5-HT、DA及NE的影響 CYP 50 mg/kg及100 mg/kg暴露組小鼠血清5-HT、DA含量均低于對照組（P＜0.05），CYP 100 mg/kg暴露組5-HT、DA含量低于CYP 50 mg/kg暴露組（P＜0.05）；CYP暴露組與對照組NE含量比較差異無統計學意義。見表3。

表3 未成年小鼠血清5-HT、DA、NE含量比較

3 討論

擬除蟲菊酯是脂溶性化合物，能夠穿過血腦屏障到達中樞神經系統，動物未成年期大腦處于高度活躍的神經發育階段，未成年期暴露易導致潛在的神經毒性，且使動物成年后再暴露時易感性增加［8-9］。擬除蟲菊酯從血液和神經組織中消除緩慢，反復暴露會導致毒物在體內蓄積，增加神經退行性疾病的易感性［10］。

單胺類神經遞質包括5-HT、DA、NE等，單胺類神經遞質含量的異常影響著神經系統的正常功能。Karen等［11］研究發現，擬除蟲菊酯能降低C57BL/6成年小鼠紋狀體突觸小體對DA的攝取，影響小鼠的運動及攝食。DA廣泛分布于中樞神經系統，大腦中DA含量與肌肉協調能力密切相關，當腦組織DA含量降低時，動物運動能力下降［12］。DA合成速度主要取決于體內的酪氨酸羥化酶，擬除蟲菊酯可通過抑制體內酪氨酸羥化酶的活力，催化合成DA含量減少［13］。NE在DA作用的基礎上引發機體進行一系列動作，NE參與維持中樞神經遞質之間的動態平衡。5-HT又名血清素，是一種神經遞質和內源性活性物質，廣泛分布于中樞神經系統和周圍組織。擬除蟲菊酯類代謝產物殘留會造成腦組織各部位5-HT含量下降，且降低程度與擬除蟲菊酯的使用量及使用頻率有關［14］。擬除蟲菊酯引起Na+通道關閉延遲，神經元去極化，神經元過度興奮，進而干擾神經遞質5-HT的正常傳遞［15］。

本研究以CYP 50 mg/kg、100 mg/kg對C57BL/6未成年小鼠進行腹腔注射，觀察小鼠腦臟器系數、大腦皮質及血清中單胺類神經遞質5-HT、DA、NE的變化。結果發現，暴露組（CYP 100 mg/kg）小鼠腦的臟器系數高于對照組，差異有統計學意義。暴露組小鼠大腦皮質及血清中5-HT、DA含量低于對照組，且CYP 100 mg/kg暴露組小鼠大腦皮質及血清中DA含量和血清中5-HT含量低于CYP 50 mg/kg組，差異均有統計學意義。由于神經遞質測定方法靈敏度較高，特別是單胺類神經遞質含量的個體差異較大，本次實驗NE在腦皮質和血清中沒有達到較為一致的變化趨勢，這與柴曉靜等［16］的研究不完全一致，可能與暴露方式、暴露時間、暴露劑量以及實驗動物的樣本量有關。

綜上所述，CYP暴露影響C57BL/6未成年小鼠腦臟器系數，降低小鼠大腦皮質及血清中單胺類神經遞質5-HT、DA的含量，單胺類神經遞質的變化可能是CYP導致神經系統毒性的物質基礎，神經損傷的具體途徑及相關機制是本實驗下一步的研究方向。