海洋硅藻細胞表面物理化學特性對鎘累積的影響

馬捷，陳豐源，周貝貝，段丹丹，韋陽，潘科

深圳大學高等研究院，深圳 518060

硅藻是海洋浮游植物的主要類群，也是海洋生態系統中的重要初級生產者。硅藻具有種類多、數量大、繁殖快等特點，其生物量可占海洋浮游植物的50%以上[1]。硅藻在真光層中吸收二氧化碳和營養鹽，通過沉降作用向深海輸出生源要素，在海洋生態系統的物質循環和能量流動過程中扮演重要角色[2-3]。

圖1 浮游植物吸收痕量金屬的過程注：MZ+為自由金屬離子；ML為溶液中的金屬絡合物；M-X為細胞表面的金屬絡合物；kf，kf’為細胞表面金屬絡合物的生成速率常數；kd，kd’為細胞表面金屬絡合物的解離速率常數；kint為金屬跨膜運輸的速率常數；DML，DMZ+分別為溶液中金屬絡合物和自由金屬離子到達細胞表面擴散層的擴散系數。[8]Fig. 1 The process of the trace metal accumulation by phytoplanktonNote: MZ+ stands for free metal ion; ML stands for metal complex in solution; M-X stands for metal complex on the cell surface; kf, kf’ stand for rate constant for the formation of the metal complex in cell surface; kd, kd’ stand for rate constant for the dissociation of the metal complex in cell surface; kint stands for rate constant of metal across the membrane; DML, DMZ+ stands for diffusion coefficient for the diffusing of the metal complex and free metal ion to the cell surface diffusion layer. [8]

此外，硅藻在Cd的生物地球化學循環中同樣發揮了關鍵的作用[4]。一方面，硅藻中的Cd可以通過食物鏈一步步富集，最終對人體健康產生危害[5]；另一方面，在缺乏痕量金屬的大洋區域，硅藻可利用Cd代替鋅(Zn)作為碳酸酐酶中的輔因子來催化二氧化碳的水化反應[6-7]，這一過程對碳循環具有重要意義。因此，研究海洋硅藻吸收Cd的過程，不僅有利于深入了解Cd在海洋生態系統中的遷移規律，而且有利于厘清硅藻在Zn限制條件下的適應性機制。本文從硅藻累積Cd的過程出發，分析環境因子對硅藻細胞表面形貌及其物理化學特性的影響，討論硅藻細胞表面特征與其吸附Cd之關系，為了解硅藻吸收金屬的機制提供新思路。

1 浮游植物吸收痕量金屬的過程(The process of the trace metal accumulation by phytoplankton)

浮游植物吸收痕量金屬的過程可以分為以下4步：(1)溶液中的金屬離子擴散至細胞表面附近；(2)金屬離子進入細胞粘液層或細胞壁；(3)金屬離子被吸附到細胞壁或細胞膜的結合位點；(4)金屬離子緩慢且不可逆地跨越細胞膜，被轉運至細胞內，并與胞內不同的組分結合[8](圖1)。可見，浮游植物吸收重金屬的過程既涉及水環境化學，又與生物過程密不可分。任何影響上述步驟的因子均會改變浮游植物吸收重金屬的速率。

海水中的重金屬離子或以自由離子的形態存在，或與無機配體或有機配體結合，或吸附于不同顆粒物表面。大量的研究表明，水體中痕量金屬的生物可利用性或毒性主要取決于自由態金屬離子的濃度，而不是水中金屬的總濃度。早期研究從多個方面揭示了水化學因子對藻類吸收重金屬的影響。溶解性有機碳(DOC)可以有效降低金屬的自由離子濃度，減少藻類對金屬的累積[9-11]。在淡水環境中，pH是影響藻類累積重金屬的主要因素。pH低時，環境中H+會與金屬離子競爭藻類細胞表面的吸附位點；反之pH過高時，金屬離子會生成不溶性的氫氧化物；在pH為4～8范圍內，藻類對大部分金屬離子的吸附能力較強[12-13]。海水的pH范圍一般穩定在8.0左右，因而海洋藻類對金屬有較強的吸附效應。此外，水體中離子強度也會影響金屬離子的可利用性。研究表明，當海水鹽度從5‰升高到25‰時，Hg、Cd、Cu、Zn、Ni、Pb等金屬的自由離子濃度會顯著降低，毒性也隨之下降[14-15]。

早期的研究多數強調環境理化因子對浮游植物吸收重金屬的直接作用，往往較少關注理化因子所引致的生物效應對吸收過程的影響。實際上，環境因子不但會影響金屬的生物可利用性，而且會改變浮游植物的生理生化特征，間接作用于金屬的累積過程。例如，光照和溫度會改變水體中自由離子(free ion)的濃度。增加光強或光照時間可促進絡合態鐵的解離，使鐵的生物有效性提高[16]。另一方面，光照、溫度和營養鹽會影響浮游植物的生化成分、蛋白活性和生物有效體積[17]。即，環境可以通過調節浮游植物的生長間接影響浮游植物吸收金屬的過程[18]。Wang和Dei[19]通過改變營養鹽濃度來控制硅藻(Thalassiosirapseudonana)的生長，他們發現硅藻的生長速率與Cd、Se、Zn的吸收速率成正比。類似的生長-吸收關系同樣見于自然海域。Luoma等[20]觀察到舊金山灣的顆粒Cd和顆粒Zn濃度在春季水華時期會大幅增加。浮游植物的Cd含量似乎與其粒徑呈正比。Cullen等[21]發現浮游植物的粒徑越大，其細胞內的Cd濃度越高。與此相似，西太平洋真光層中懸浮有機顆粒物的粒徑也與顆粒Cd濃度正相關[22]。然而，這種現象背后的機制仍未清楚。一種推測是環境因子改變了浮游植物細胞大小，從而影響了它們吸附金屬的能力。有趣的是，Miao等[23]研究發現，T.pseudonana吸收Cd的速率與藻類細胞大小、光合作用活動、細胞周期并無直接聯系。這意味著細胞大小不是環境因子調控硅藻吸收Cd的唯一機制。

由上可見，浮游植物吸收重金屬是一個受多因素制約的復雜過程。理解這一過程不但要分析水中金屬離子的化學形態特征，而且要研究相應條件下浮游植物生理狀態。在金屬離子進入藻類細胞內部之前，金屬離子會首先與藻類表面的各類生物分子結合。這一生物吸附過程很大程度制約了金屬的內化速率。藻類細胞的表面物理化學特性如何影響其吸附金屬的能力，尚有待深入研究予以揭示。

2 多變的硅藻細胞表面形貌及其物理化學特性(The diversity of surface morphology for diatoms and their physicochemical properties)

除了隱藻、裸藻和金藻，大部分浮游植物細胞外層都包覆有細胞壁。浮游植物的細胞壁形態各異，通常分為內外兩層。例如綠藻細胞壁的外層為果膠質，內層為纖維質。而硅藻的細胞壁較為特殊，主要由硅質(SiO2·nH2O)外殼和果膠質內層組成[24]。硅質殼(frustule)分為上下2個殼面，它們形態相似，大小不等，相互套合，形如培養皿。硅藻外形及紋理通常具有規律性[25]。硅質殼的物理化學性質接近于石英玻璃。Hamm等[26]發現羽紋綱硅藻殼體肋部和環帶可分別承受約680和330 MPa的壓力而不被破壞。此外，硅質殼外包裹了一層由多糖和蛋白組成的有機被膜(organic coating)。被膜富含羧基、氨基和硅醇基等基團，為各種金屬離子提供了豐富的結合位點[27]。

硅藻的表面形貌結構具有一定的可塑性。當光照強度、溫度、營養鹽水平、pH、鹽度、捕食壓力、污染物濃度等因子改變時，硅藻細胞的大小、細胞壁的輪廓和紋理、以及細胞壁的組分均可發生變化[28]。例如，弱光照會導致膨脹海鏈藻(Thalassiosiratumida)細胞殼面直徑的顯著減小[29]。此外，硅藻的形態特征與溫度密切相關。Montagnes和Franklin[30]發現，水溫每升高一攝氏度，硅藻的細胞體積會降低約4%。當水體的pH值過高或過低時，硅藻細胞殼面輪廓會發生變形[31]。當硅藻的生長受到N、P和Si等營養元素限制時，其體積和表面積會同時縮小[32]。此外，Cu、Zn和Cd等金屬的毒性效應會造成硅藻細胞畸變。例如0.2 mmol L-1的Cd能引起三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)表面出現類似螺旋的微觀結構[33]。可見，環境因子很大程度上影響了硅藻形態特征。究其原因，是環境因子改變了硅藻細胞的光合作用活性[34]和細胞組分[35]，又或抑制了營養鹽的吸收[36]和相關蛋白質的合成[37-38]，從而間接影響細胞的生理狀態，包括細胞壁的生長和細胞的表面物理化學特性。

值得注意的是，這些微觀結構的變化很可能會影響硅藻吸收利用金屬的能力。首先，細胞大小的變化會改變細胞的比表面積，而細胞的比表面積是影響藻類吸收痕量金屬的關鍵因素[39]。再者，當環境因子改變時，細胞表面的物理化學屬性，例如表面粗糙度、表面電荷密度，或者官能團的種類和數量會發生改變，從而影響硅藻對金屬離子的吸附[40-41]。早期的研究主要利用光學顯微鏡和電子顯微鏡對硅藻的表面形貌進行定性描述，鮮有研究定量地測定環境因子如何影響硅藻的微觀特性，例如表面粗糙度和表面電勢。隨著技術的發展，我們可以利用原子力顯微鏡技術(Atomic Force Microscopy, AFM)定量測定細胞表面細微結構的各種物理特性(粗糙度、表面電勢、彈性、硬度、摩擦力等)。與其他顯微技術(如熒光顯微鏡和電子顯微鏡等)不同，AFM對制樣的要求很少，無需進行染色或包裹處理。它可以直接獲得生物樣品(例如細胞、蛋白或DNA分子)的三維表面形貌和表面物理特性，可最大程度地反映硅藻的自然表面特性。借助于AFM技術，我們可以深入研究不同環境條件下硅藻表面物理特性與其吸附金屬之間的關系。

3 硅藻細胞表面物理化學特性與Cd累積之關系(The relationship between the physicochemical properties of diatom cell surface and Cd accumulation)

硅藻吸附Cd是一個發生在細胞表面固液界面的復雜物理、化學與生物過程。硅藻細胞的表面物理化學特性(粗糙度、粘附力、基團的種類和數量)直接影響了細胞表面與水溶液中的金屬離子的相互作用，從而改變了金屬離子在藻細胞中的內化速率[39-44]。

3.1 硅藻表面粗糙度與鎘吸附

顯而易見，硅藻表面的粗糙度首先反映了細胞表面積的大小。粗糙度越大細胞接觸水體的面積越大。但目前較少研究以表面粗糙度來定量描述藻類的表面特征。Henke等[45]利用AFM測量了二氧化硅基片的粗糙度。他們發現基片的粗糙度越大，比表面積就越大，基片能共價結合的有機基團就越多。換而言之，基片能提供的金屬離子結合位點會大大增加。藻類細胞的表面粗糙度會隨環境而變。Vrieling等[46]發現，低鹽度下威氏海鏈藻(T.weissflogii)的細胞表面粗糙度會增加。這是因為低鹽度會導致硅藻細胞表面形成粒徑更小、結構更為致密的納米二氧化硅結構。我們在研究中也有類似發現。當鹽度從32‰降低到18‰后，新月菱形藻(Nitzschiaclosterium)的細胞表面粗糙度顯著增加，而且單位細胞面積吸附Cd更多(圖2，Ma等，待發表數據)。營養鹽供應同樣會影響硅藻的表面粗糙度，例如缺硅會造成硅藻細胞壁形成缺陷區域而增加細胞表面粗糙度。有趣的是，缺硅細胞吸附Cd的能力不升反降。深入研究后發現，雖然缺硅細胞的表面積增大，但其表面的功能基團的種類和數量同時改變(見下)，其總效應為硅藻細胞吸附Cd的能力下降。

圖2 低鹽度(18 psu)和高鹽度(32 psu)條件下硅藻(Nitzschia closterium)細胞的形貌、表面粗糙度的原子力顯微鏡(AFM)示意圖注：(a)低鹽度條件下的細胞表面AFM形貌圖，(b)為(a)中紅框部分放大的3D形貌圖；(c, d)對應的高鹽度條件下的細胞AFM圖像；由(b, d)可見低鹽度和高鹽度條件下細胞的表面粗糙度存在顯著差異(數據來自Ma等，待發表數據)。Fig. 2 Atomic Force Microscopy (AFM) images of N. closterium cells acclimated at 18 and 32 psuNote: (a and c) AFM 3D images showing the representative morphology of the diatom cells. (b and d) Amplified 3D morphology of typical difference in roughness in 2 × 2 μm (amplified the square frame area in red) area on the cell walls of cells cultivated at salinities of 18 and 32 psu, respectively (Ma et al., in press).

圖3 不同鹽度(18, 32 psu)或硅濃度(Low-, High-Si)條件下硅藻(Nitzschia closterium)細胞表面電勢的原子力顯微鏡示意圖注：(a)低鹽度條件下的細胞表面AFM形貌(上)和電勢(下)圖，(b)為對應高鹽度的細胞圖；(c, d)低硅和高硅條件下的細胞圖像。由電勢圖像可見鹽度和硅營養條件都會影響細胞的表面電勢(數據來自Ma等，待發表數據)。Fig. 3 AFM morphology (up) and surface potential (down) images of N. closterium cells acclimated at 18 and 32 psu, or Low- and High- silicon conditionsNote: (a) Representative AFM potential images of the diatom cells acclimated at 18 psu; (b) Corresponding potential images of the diatom cells acclimated at 32 psu; (c and d) Representative morphology and potential images of the diatom cells acclimated at Low- and High-Si conditions. Both salinity and silicon level can influence the cell surface potential. (Ma et al., in press).

3.2 硅藻表面功能基團與鎘吸附

硅藻的表面功能基團是影響硅藻吸附金屬的另外一個重要因素。硅藻細胞壁主要由肽聚糖、多糖、脂質和蛋白構成。這些組分中的羧基、氨基、硅醇基和巰基等功能基團帶有負電，對吸附金屬離子起關鍵作用[35]。從元素構成來看，新月菱形藻(N.closterium)細胞壁上的C和O可占到細胞壁的80%以上，而Si和N元素也可占到5%～15%，P和S元素所占的比例則在2%左右，其他元素通常情況下所占比例低于1%[47]。作為一種軟金屬離子，理論上Cd更易于與硫醇等含硫的基團結合。但硅藻細胞壁的S原子比較低，因此硫醇基團在吸附Cd的過程中所起的作用有限。我們認為，對硅藻細胞壁吸附Cd起決定性作用的，主要還是C、O、Si、N等元素構成的功能基團[48]。

通過X射線光電子能譜(XPS)研究發現，硅藻細胞表面功能基團的組成和比例會隨環境條件而變。當環境中Si缺乏時，N.closterium細胞壁的Si原子比會顯著下降(從19.2%降至4.5%)。同時，細胞壁Si的形態也會發生明顯變化——二氧化硅的比例下降，而低密度無定形硅酸的比例上升。這一系列變化的最終結果是細胞表面SiO-基團密度減少，降低了細胞壁吸附Cd的能力[47]。大量研究表明，鹽度對藻類吸收金屬離子具有顯著的調控作用。低鹽度會促進藻類對金屬離子的吸收，并引起更強的金屬毒性效應。這是因為在相同金屬濃度下，鹽度越低，自由金屬離子的比例越高。鹽度變化并不會導致新月菱形藻細胞壁Si含量產生變化。然而，鹽度從32 psu降低到18 psu時，硅藻(P.tricornutum和N.closterium)細胞壁的Si多以SiO-的形式存在。而且低鹽度時O:C的比例升高，這說明含O的負電基團(例如羧基)等增多；此外，低鹽度下S的原子比也會顯著升高，表明細胞壁中含硫基團的數量有所提升，這對提高細胞對Cd的親和力具有重要作用(Ma等, 待發表數據)。

3.3 硅藻的表面電勢與鎘吸附

細胞的表面基團的種類和數量決定了其表面電勢。后者直接決定了藻細胞對金屬離子的吸附能力。Gélabert等[39]通過電泳遷移率的方法測定了硅藻表面電勢，他們發現硅藻表面的羧基和硅醇基團在吸附Zn的過程中起到了主要作用。進一步的研究表明，羧基的電負性比羰基和硅醇基等基團更強，富含羧基的細胞壁極性更高，因而能吸附更多的Zn和Cd[49]。然而，這些研究均以細胞群體作為測量對象，沒有原位測量藻類單細胞的表面電勢，缺乏細胞表面結構-電化學性質之間直接關聯的證據。而AFM可以在單個細胞或者分子上同時原位探測生物(分子)表面結構和電勢，為深入了解藻類表面物理化學特性鋪開了道路。

目前有關環境因子對硅藻細胞表面電勢的影響研究幾近空白。已有一些研究者使用AFM研究外界刺激對動物細胞表面電勢的影響。Tsai等[50]利用開爾文探針力顯微鏡(KPFM)測量了小鼠腫瘤細胞表面電勢。結果發現，經過H2O2和Zn離子預處理的細胞表面電勢更高，這一結果為進一步借助KPFM研究環境因子對硅藻表面電勢的影響提供了經驗。我們的初步研究結果顯示，低鹽度或者高Si條件下培養的硅藻(N.closterium)細胞的表面電勢更低(圖3，待發表數據)。結合上述XPS結果可知，這是由細胞表面更多帶負電荷功能基團引起的。

細胞表面電勢的變化最終會影響硅藻細胞吸收Cd的速率。Yang等[51]利用非損傷微測技術(NMT)測量了硅藻(Cylindrothecasp.)表面的Ca離子流。發現細胞表面電勢減弱后，Ca離子的外排速率加快。有趣的是，Ma等[52]報道，水稻懸浮細胞的表面電勢在Si限制條件下更弱，但其吸收Cd的速率卻較高。NMT能反映出細胞表面電勢差與離子流速之間的關系，這使它成為了一種研究細胞生物學和生理學極為有效的工具[53]。但目前為止，針對藻類單細胞表面Cd離子流的研究卻非常匱乏。

綜上所述，硅藻累積Cd的動力學過程與碳等關鍵生源要素的生物地球化學循環密切相關。環境條件(鹽度、營養鹽、pH、光照、溫度)會影響硅藻累積Cd，但其背后的調控機制有待我們進一步挖掘。已有的研究表明，硅藻細胞的表面形貌在不同環境條件下有較大變化。這些變化包括了直觀可見的細胞表面結構的改變，也包括了潛在的物理特性轉變。重要的是，這些微觀的變化可能對Cd的內化與轉運過程產生深遠的影響。環境因子如何影響硅藻細胞的表面物理特性，并作用于硅藻累積Cd的關鍵過程，均有待系統闡明。環境因子會改變硅藻細胞表面的粗糙度和表面電勢，影響硅藻細胞吸附Cd的能力和Cd的內化速率，并最終影響硅藻細胞的Cd含量。未來采用多學科交叉的研究思路，從機理上對上述問題進行深入的剖析和探討，研究環境因子-硅藻表面物化特性與硅藻吸收Cd過程之關系，從而拓展我們對硅藻吸收利用痕量金屬的認識。