Cu和Pb對赤潮異彎藻(Heterosigma akashiwo)生長的影響

鄧紫云，陳清香,2,*

1. 廣東海洋大學海洋與氣象學院，湛江 524088 2. 廣東省近海海洋變化與災害預警重點實驗室，湛江 524088

隨著經濟迅速發展，大量的重金屬通過各種途徑進入海洋，成為當前海洋的重要污染物。根據國家環境總局資料公布，我國相當一部分近海海水中的重金屬濃度已超過國家一類海水水質標準(GB3097—1997)，有些污染嚴重的海區已經超過國家二類海水水質標準近2倍。

由于種類和濃度不同，重金屬對海洋生態系統產生的影響差別較大；對生長周期短的浮游植物的生長、分布和群落結構都會產生較大影響，尤其是赤潮藻類的變化對海域生態環境會造成嚴重的影響。

赤潮異彎藻(Heterosigmaakashiwo)是一種魚毒性藻類，具有極強的溶血性，對魚類、貝類都有強毒性[1-2]。赤潮異彎藻在世界上多個海灣或河口都有形成赤潮的記錄，學者對該赤潮藻種的生態、生理和分子生物學等多方面都進行了研究[2-11]。赤潮異彎藻的生理特征和毒性，使其能在全球范圍內廣泛分布并對生態造成嚴重影響。此藻在10～30 ℃內均能生長[5-6]，且在25 ℃生長最佳[7]，生長速率最高，能達到的藻密度最高；能適應的鹽度為10～35[5]，最適鹽度范圍為20～25[7]，低鹽(10)條件下藻生長速率最低[8]；太陽輻照度對藻的光合作用有顯著影響[9]，光照周期為18 L∶6 D周期時生長最好[10]。N為37.5～225.0 mg·L-1、P為5.0～50.0 mg·L-1，且N/P達到25時最適合赤潮異彎藻生長[11]。

有關重金屬對赤潮異彎藻的研究也已有報道。較高濃度的Cu對赤潮異彎藻有明顯的抑制效果[12]，Cu濃度為0.5 mg·L-1時，Cu能明顯抑制赤潮異彎藻的生長，超過此濃度時藻種基本不能存活；Pb在較低濃度(≤0.5 mg·L-1)時，能促進赤潮異彎藻生長；濃度為1.0～5.0 mg·L-1范圍中，Pb表現出一定的毒性；當濃度達到10.0 mg·L-1時，藻的生長受到明顯的抑制作用[13]。但2種重金屬同時脅迫赤潮異彎藻的實驗還未見報道，而近岸環境中重金屬污染加劇，且是多種重金屬元素同步增加，因此研究多種重金屬共同影響赤潮異彎藻的結果更有利于環境預警。本實驗選擇Cu和Pb 2種重金屬同時作用于赤潮異彎藻，以期了解多種重金屬對微藻的共同作用效果。

隨著湛江灣周邊的大型鋼鐵、石化和造紙業的蓬勃發展，加上地形導致的灣內外水體交換較弱，污染物停留在灣內的時間較長，必定會對湛江灣的生態環境產生影響。重金屬、營養鹽等多種因子對浮游植物的影響尤為迅速且復雜，重金屬的種類和濃度以及營養鹽的濃度不同組合，對浮游植物的群落結構會產生不同影響。根據生態效應浮游植物可以分為餌料藻和赤潮藻，誘發無毒的餌料藻或有毒的赤潮藻旺發，對海洋環境會產生截然不同的生態效應，赤潮異彎藻是近年來在調查湛江灣時發現的有潛在危害的藻種，赤潮異彎藻的營養需求或對單種重金屬敏感濃度都已有一些報道，但多種因子共同作用的影響還未見報道。因此，本研究擬在N、P營養鹽濃度較高且穩定的條件下，研究2種常見重金屬Cu和Pb單獨或共同作用時，對赤潮異彎藻生長的影響，從而為預測湛江灣實測環境因子誘發赤潮異彎藻旺發的可能性提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

赤潮異彎藻購買自上海光語生物科技有限公司，用f/2營養液在室內常溫條件下培養，光源為日照漫射光，在整個培養過程中，所使用的儀器均進行高溫滅菌(120 ℃, 45 min)，實驗操作過程均在超凈工作臺進行，器皿使用前進行30 min紫外滅菌。

儀器包括光學顯微鏡(Olympus BX53)、超凈工作臺(VS-1300U)、高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS-50S)、電子天平(Sartoriu BT125D)等。試劑包括分析純CuSO4·5H2O、分析純Pb(NO3)2；培養液配制試劑有NaNO3、NaH2PO4·H2O、Na2SiO3·H2O、Na2EDTA、FeCl3·6H2O；人工海水配制試劑：(A液)NaCl、KBr、Na2SO4、H3BO3、KCl、NaF、NaHCO3，(B液)MgCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、SrCl2·6H2O。

1.2 銅和鉛對赤潮異彎藻生長影響實驗

將赤潮異彎藻細胞逐步加入f/2人工海水培養基培養至指數生長期，正式開始試驗前將藻細胞進行饑餓3 d處理。實驗時用人工海水將藻液稀釋，使赤潮異彎藻的起始細胞密度約為5×104cell·mL-1，僅添加N=75 mg·L-1、P=5 mg·L-1作為營養元素，N/P=25，混勻分裝后，另外加入已配制好的不同濃度的Cu和Pb(采用分析純CuSO4·5H2O、Pb(NO3)2配制)進行實驗。第一個實驗中，Cu的濃度系列為0、0.02、0.1、0.5、2.5 mg·L-1；Pb的濃度系列為0、0.04、0.08、0.16、0.32 mg·L-1。第二個實驗中，Cu的濃度系列為0、0.02、0.1、0.25、0.5 mg·L-1；Pb的濃度系列為1、3、5、7、9 mg·L-1。2個都是全因子實驗，每個實驗共25組，設置2個平行。

1.3 數據統計與分析

在顯微鏡下計算細胞密度，重復計數3～4次。將計數的藻細胞數用Excel初步處理，算出最大生長密度及生長周期，再根據公式計算細胞比生長速率：

μ=2.303(lgNt-lgN0)/(t-t0)

式中：Nt、N0分別表示t、t0時刻的細胞密度[11]。

將3個參數指標用SPSS 19.0進行方差分析，并采用Origin Pro進行畫圖。

2 結果(Results)

2.1 Cu和Pb對赤潮異彎藻生長的影響

在Cu和Pb的共同作用下，赤潮異彎藻生長情況發生改變。如圖1，在Pb濃度相同時，不同濃度的Cu對藻細胞密度有影響。Cu為0.02 mg·L-1的藻細胞生長曲線與0 mg·L-1的趨勢相似，且有一定的促生長作用，但當Cu濃度大于0.02 mg·L-1時，對藻生長有明顯的抑制作用，高于0.5 mg·L-1時，藻細胞全部死亡。從圖2可以看出，在Cu濃度相同的條件下，不同Pb濃度的藻生長趨勢相似，表明Pb濃度在0～0.32 mg·L-1范圍內時，對藻細胞密度影響差異不大。Pb在0～0.32 mg·L-1范圍內，隨著濃度的增加，對赤潮異彎藻有一定促進作用。但當銅濃度達到0.5 mg·L-1時，完全掩蓋了低濃度Pb對赤潮異彎藻生長的促進作用。

在高Pb濃度下(圖3)，Cu在0～0.1 mg·L-1的范圍內的赤潮異彎藻生長趨勢相似，隨著Cu濃度的增加對赤潮異彎藻有一定的促生長作用。這與在低濃度Pb條件下的Cu對赤潮異彎藻有促生長效果的范圍不一樣，這可能是Cu和Pb之間存在拮抗作用。當Cu濃度在0.25～0.5 mg·L-1時，對藻生長有明顯的抑制作用逐步增加，直至死亡。從圖4可以看出，在不同的Cu濃度下，高濃度Pb對赤潮異彎藻生長有一定的影響。與低濃度Pb對比，在高濃度Pb條件下，藻細胞密度明顯降低，表明Pb在1～9 mg·L-1時對赤潮異彎藻有一定的毒性，且隨著Pb濃度的增加抑制作用增強，Pb為9 mg·L-1時抑制作用最明顯。

圖1 Pb低濃度時不同濃度Cu對赤潮異彎藻生長的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of Cu on the growth of Heterosigma akashiwo at low Pb concentrations

圖2 Cu濃度不同時低濃度Pb對赤潮異彎藻生長的影響Fig. 2 Effect of low concentration of Pb on the growth of Heterosigma akashiwo in different concentrations of Cu

圖3 Pb高濃度時不同濃度Cu對赤潮異彎藻生長的影響Fig. 3 Effects of different concentrations on the growth of Heterosigma akashiwo at high Pb concentration

圖4 Cu濃度不同時高濃度Pb對赤潮異彎藻生長的影響Fig. 4 Effect of high concentration of Pb on the growth of Heterosigma akashiwo in different concentrations of Cu

總之，低濃度的Cu(0～0.02 mg·L-1)和Pb(0～0.32 mg·L-1)能促進藻細胞生長，隨著濃度的增加，對赤潮異彎藻生長的促進作用越來越強。在高濃度Cu(≥0.5 mg·L-1)的影響下，藻生長受到明顯抑制，幾乎所有赤潮異彎藻都無法正常生長；高濃度Pb(1～9 mg·L-1)對赤潮異彎藻有一定的抑制生長作用，但沒有高濃度Cu明顯。

2.2 Cu和Pb對赤潮異彎藻生長影響的參數分析

分析赤潮異彎藻的最大生長密度、生長周期以及比生長率可以基本了解赤潮異彎藻的生長情況、不同濃度Cu和Pb對藻細胞生長影響的差異，也可以用來比較不同濃度Cu、Pb的組間差異。

2.2.1 不同濃度Cu和低濃度Pb對赤潮異彎藻生長影響實驗結果分析

表1為不同濃度的Cu(0～2.5 mg·L-1)和Pb(0～0.32 mg·L-1)作用下的赤潮異彎藻的最大生長密度、生長周期和比生長率的統計結果。藻細胞最大生長密度的最高值基本分布在Cu為0.02 mg·L-1時。在Cu為0.5～2.5 mg·L-1時，藻細胞密度顯著減少，甚至為0，顯示出不同濃度的Cu對赤潮異彎藻的最大生長密度影響較大。從生長周期來看，赤潮異彎藻生長周期最長能達到31 d，組間差異明顯。最長的生長周期和最短的生長周期基本分布在Cu濃度為0.02 mg·L-1和2.5 mg·L-1的組別。比生長率的波動較大，這可能是由于2種重金屬在不同濃度時對赤潮異彎藻的抑制和促進作用不同。

表2為不同濃度的Cu(0～2.5 mg·L-1)和Pb(0～0.32 mg·L-1)對赤潮異彎藻生長影響的各參數方差分析(F檢驗)結果。不同Cu濃度的藻最大生長密度、生長周期以及比生長率的差異顯著(P<0.01)；而不同Pb濃度的藻最大生長密度有顯著差異(P<0.05)，其余2個參數均無顯著差異。不同濃度的Cu和Pb互作對赤潮異彎藻的最大生長密度有顯著影響(P<0.01)，而對其生長周期和比生長率無顯著影響。由此可見，在此濃度范圍內，Cu對藻細胞生長的影響大于Pb的影響。

表1 不同濃度Cu和低濃度Pb對赤潮異彎藻生長影響的參數描述性統計Table 1 Descriptive statistics of different concentrations of Cu and low concentrations of Pb on Heterosigma akashiwo growth

注：M為平均數；SD為標準差。

Note: M is the mean; SD is standard deviation.

圖5 不同濃度Cu和低濃度Pb對赤潮異彎藻生長影響的參數統計圖Fig. 5 Statistical analysis of the effects of different concentrations of Cu and low concentrations of Pb on Heterosigma akashiwo growth

圖5為不同濃度的Cu(0～2.5 mg·L-1)和Pb(0～0.32 mg·L-1)對赤潮異彎藻生長影響的參數統計圖。最大生長密度的點在Cu濃度為0～0.1 mg·L-1時分布比較零散，Cu濃度相同的點分布不在同一條直線上，表明在這個范圍內赤潮異彎藻生長受到Cu和Pb的影響較大。在Cu濃度為0.5～2.5 mg·L-1時，Pb對藻生長的影響被完全掩蓋，而Cu對生長的影響明顯。在生長周期圖中，同濃度Cu的點基本分布在一條直線上，說明Pb對生長周期的影響較小。Cu濃度為0～0.1 mg·L-1范圍的點分布較近且在上方，而Cu為0.5～2.5 mg·L-1時，散點分布在下方，說明Cu對藻細胞生長周期影響較大，且出現兩極化，高濃度Cu(0.5～2.5 mg·L-1)明顯縮短藻細胞生長周期。另外，不同濃度的Cu(0～2.5 mg·L-1)和Pb(0～0.32 mg·L-1)對赤潮異彎藻的比生長率影響效果與最大生長密度的影響效果相似。

2.2.2 不同濃度Cu和高濃度Pb對赤潮異彎藻生長影響實驗結果分析

經匯總統計(表3)，不同濃度Cu(0～0.5 mg·L-1)和Pb(1～9 mg·L-1)作用下，藻細胞最大生長密度的最高值基本分布在Cu為0.1 mg·L-1時。在Cu為0.5 mg·L-1時，藻細胞密度顯著減少。與低濃度Pb實驗相比，該高濃度Pb的實驗條件下的赤潮異彎藻最大生長密度整體偏低，表明高濃度Pb對赤潮異彎藻有一定的毒性。從生長周期來看，Cu濃度在0～0.25 mg·L-1范圍內，赤潮異彎藻生長周期較均等，當Cu濃度達到為0.5 mg·L-1，藻生長周期明顯縮短。

表4為不同濃度的Cu(0～0.5 mg·L-1)和Pb(1～9 mg·L-1)對赤潮異彎藻生長影響的各參數方差分析(F檢驗)結果。從表5可知，不同濃度的Cu和不同濃度的Pb，以及Cu和Pb的互作，對赤潮異彎藻的最大生長密度和生長周期存在顯著差異(P<0.01)。不同濃度的Cu和Pb及其互作都對赤潮異彎藻的比生長率沒有顯著差異的影響。

不同濃度的Cu(0～0.5 mg·L-1)和Pb(1～9 mg·L-1)對赤潮異彎藻生長影響的參數統計圖，如圖6所示。最大生長密度的點分布比較零散，其中Cu濃度為0.5 mg·L-1時，散點分布趨于同一條直線上，表明赤潮異彎藻生長受到Cu和Pb的影響較大，但當Cu濃度為0.5 mg·L-1時，Pb對藻生長的影響被完全掩蓋。在生長周期圖中，Cu濃度為0～0.25 mg·L-1范圍的點分布較近且在上方，而Cu為0.5 mg·L-1的散點分布在下方，說明Cu對藻細胞生長周期影響較大，且出現兩極化，高濃度Cu(0.5 mg·L-1)有明顯縮短藻細胞生長周期的作用。從比生長率來看，各個散點基本集中在一起，不同濃度的Cu(0～0.5 mg·L-1)和Pb(1～9 mg·L-1)對赤潮異彎藻的比生長率影響不大。

3 討論(Discussion)

3.1 Cu和Pb對海洋浮游藻類生長和群落結構的影響

從結果可以看出，高濃度的Cu和Pb對赤潮異彎藻的生長具有抑制作用，這可能是高濃度的重金屬離子對赤潮異彎藻細胞線粒體有損傷，影響光合作用的電子傳遞系統，阻礙蛋白質合成，從而抑制了藻細胞生長[14-15]。當Pb濃度在0～0.32 mg·L-1時，較低濃度的Cu(0～0.2 mg·L-1)對赤潮異彎藻的生長有一定的促進作用，較高濃度的Cu(0.5 mg·L-1、2.5 mg·L-1)對藻細胞有明顯抑制，這與前人研究結果一致[12]。Cu濃度相同時，低濃度Pb(0～0.32 mg·L-1)對赤潮異彎藻的生長有促進作用，但當Cu濃度超過0.5 mg·L-1時，Cu對藻細胞的抑制作用掩蓋了低濃度Pb的促進效果，顯示出低促高抑的Hormesis效應[16]。Pb濃度在1～5 mg·L-1時對赤潮異彎藻有一定的毒性，當Pb濃度在7～9 mg·L-1范圍內，隨著Pb濃度的升高，對赤潮異彎藻生長的抑制作用越明顯，這與張瑩瑩[13]的研究結果一致。當高濃度Pb(1～9 mg·L-1)和不同濃度Cu的共同作用下，Cu濃度在0～0.1 mg·L-1范圍都存在促進赤潮異彎藻生長的作用，相比低濃度Pb條件下的Cu促進藻生長的濃度范圍有所擴大，這可能是Cu和Pb之間存在拮抗作用。

表3 不同濃度Cu和高濃度Pb對赤潮異彎藻生長影響的參數描述性統計Table 3 Descriptive statistics of different concentrations of Cu and high concentrations of Pb on Heterosigma akashiwo growth

注：M為平均數；SD為標準差。

Note: M is the mean; SD is standard deviation.

表4 不同濃度Cu和高濃度Pb對赤潮異彎藻生長影響的參數方差分析結果(主體間效應的檢驗)Table 4 Variance analysis of different concentrations of Cu and high concentrations of Pb on Heterosigma akashiwo growth (test of inter-subject effects)

圖6 不同濃度Cu和高濃度Pb對赤潮異彎藻生長影響的參數統計圖Fig. 6 Statistical analysis of the effects of different concentrations of Cu and high concentrations of Pb on Heterosigma akashiwo growth

不同濃度的Cu和Pb對海洋不同的浮游藻類的影響不同，一般情況低濃度Cu(0.01～0.1 mg·L-1)對浮游藻類生長有促進作用，當Cu濃度達到0.25～0.5 mg·L-1時有明顯的抑制藻生長效應[12]；Pb對赤潮異彎藻、旋鏈角毛藻、海洋原甲藻和裸甲藻等幾種不同的浮游藻類的影響差異比較大，當Pb濃度達到10 mg·L-1時，對各藻類都存在明顯的抑制作用[17]。

藻細胞可通過分泌胞外物質和利用胞內金屬硫蛋白來降低重金屬的毒性[18]，另有研究表明營養鹽濃度的高低也會影響海洋浮游植物對重金屬的耐受性，在f/2營養液的培養條件下，重金屬對海洋單細胞藻類的半最大效應濃度(EC50)值明顯高于自然海水條件下的值[17,19]，這可能是營養鹽與重金屬離子之間存在拮抗作用[20]。在本實驗中采用的是f/2營養鹽配方，營養鹽濃度遠高于真實海水，所以本實驗結果可能低估了野外環境中Cu和Pb共同作用對赤潮異彎藻生長的影響，在自然條件下重金屬對赤潮異彎藻可能會產生更大的毒性，而較低濃度的Cu和Pb能夠促進藻細胞生長，條件適宜時可能爆發赤潮。

在野外環境中，重金屬通過影響浮游藻類的正常生長，進一步影響浮游藻類的群落結構。有研究發現，高濃度Cu能夠影響藻類群落結構及組成，并且在不同的季節浮游藻類對Cu離子的響應不同[21]，另外Cu濃度增加還可能會減少浮游植物的種類，影響藻類的多樣性[22]。

3.2 海區重金屬含量分布及潛在生態影響

我國近海海域重金屬污染主要包括Cu、Cr、Zn、Cd、Pb和Hg等[23]，主要來源于化工、金屬冶煉、電鍍和輪船制造等行業。湛江灣位于粵西雷州半島的東北側，港灣東西兩岸連接大陸，有南三島、東海島、硇洲島等島嶼為天然屏障，是一個典型的口小腹大的港灣，港內海水較少與外海交換，海水流通性不強，許多陸源營養鹽和污染物匯集在港內難以擴散。

隨著湛江的發展，湛江灣的海洋環境承受的壓力越來越大，寶鋼基地和中科煉化項目的落實，以及其他工業、農業和生活污水的排放，導致湛江灣內重金屬含量升高。2008年湛江灣內，表層和底層水體的Cu含量平均值分別為4.45×10-3mg·L-1和4.49×10-3mg·L-1；水體中的Pb總體含量較低，表、底層水體的平均含量為0.76×10-3mg·L-1和0.82×10-3mg·L-1[24]。另有研究顯示，在不同季節湛江灣海域養殖區的Cu和Pb的含量不同。2010年，春季和夏季的各養殖區Cu含量范圍分別為(3.5～6.2)×10-3mg·L-1和(25.7～33.3)×10-3mg·L-1；秋季含量在(16.5～21.9)×10-3mg·L-1之間，冬季則是ND～19.5×10-3mg·L-1(ND為未檢測出)。除了春季，其他季節幾乎都超出漁業水質標準規定的含量即10×10-3mg·L-1，養殖區內Cu含量普遍偏高。4個季節中，各養殖區Pb含量相差不大，且沒超過漁業水質標準，屬于一、二類海水水質[25]。劉芳文等[26]的調查結果略有不同，2013年湛江灣內夏季Pb含量為(3.00～5.50)×10-3mg·L-1，Cu含量為(3.40～7.60)×10-3mg·L-1；冬季Pb含量為(1.50～6.50)×10-3mg·L-1，Cu含量為(2.00～6.20)×10-3mg·L-1。參照《海水水質標準》[27]中重金屬含量的標準值，湛江灣內水體中Cu含量符合國家二類海水水質標準(Cu≤10×10-3mg·L-1)，部分Pb含量超過了國家二類海水水質標準(Pb≤5.5×10-3mg·L-1)，但未達到國家三類海水水質標準(Pb≤10×10-3mg·L-1)。但在湛江灣的養殖區域內Cu的含量基本超過國家二類海水水質標準，Pb的含量基本符合國家二類海水水質標準。從湛江灣的底棲貝類重金屬含量來看，Cu和Pb的含量隨生物種類、檢測部位等不同而不同，僅有少數種類略高于國家標準[25,28]。

與本論文實驗結果對比，湛江灣內Cu和Pb的含量都是低濃度范圍，可能存在促進浮游藻類生長的作用，特別是在養殖區域。由于人工添加營養鹽，養殖區域內營養鹽含量比一般的海水環境高。在夏秋冬季，湛江灣內養殖區域附近海域的Cu濃度達到0.02 mg·L-1左右，可能會促進赤潮異彎藻的快速生長。Mohamed等[29]調查發現高養分的養蝦場徑流，可能是赤潮異彎藻爆發赤潮的重要原因。湛江灣內Cu和Pb的含量較低，不會對海洋浮游藻類生長產生明顯的抑制作用，但與本實驗相比，湛江灣海水營養鹽含量較低，重金屬對藻類表現的毒性會更強?？偟膩碚f目前湛江灣水體重金屬污染情況不是非常嚴重，但有加重的趨勢。湛江灣水體流通弱，營養鹽和重金屬易蓄積，而且赤潮異彎藻曾在湛江灣出現，因此，具有一定的潛在風險。

致謝：本研究獲得了廣東海洋大學創新強校工程項目(GDOU2016050244)和國家自然科學青年基金(C31200303)的資助。