鮑魚對2種多環芳烴的富集動力學研究

魏海峰，趙肖依,2，王闖,2，劉潘,2，劉長發,2,*，黃欣,2，霍玉潔,2，趙雨朦,2，夏寧,2

1. 大連海洋大學，遼寧省海洋近岸海洋環境科學與技術重點實驗室，大連 116023 2. 大連海洋大學，海洋科技與環境學院，大連 116023

多環芳烴化合物(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是指由2個或2個以上苯環以線狀、角狀或簇狀排列的中性或非極性碳氫化合物，是一類典型持久性有機污染物，具有強致癌和致突變性[1]。多環芳烴因其化學性質穩定、生物富集量高、難降解等特點，被列為海洋環境監測的指標之一[2-3]。

海洋環境中PAHs污染主要來源于海洋溢油事故以及沿海石油化工企業的廢水排放[4]。2008年我國進口石油2億噸的90%經海洋運輸。2010年大連“7.16溢油”和2011年蓬萊“19-3溢油”事故中，多環芳烴是一類重要的污染因子[5-6]。近年來，國內外學者對海洋中多環芳烴開展了相關研究，取得了一定的研究進展。高穎等[7]研究了海水和海洋沉積物中多環芳烴的分布情況，發現我國南黃海海水中PAHs溶解態和顆粒態中PAHs的總濃度為15.8～233.4 ng·L-1；大遼河口、黃河口中海洋沉積物中的PAHs含量均較高，其中大遼河口海洋沉積物中PAHs的含量范圍為276.3～1 606.9 ng·g-1；河口區域海洋沉積物中PAHs略高于近岸海域沉積物中PAHs。葉志波等[8]研究了消油劑對海洋溢油中PAHs環境行為的影響，發現消油劑能增大溢油中PAHs在海水中的溶解度，促進形成粒徑更小的化學分散油滴，而較小的油滴更容易和海洋中懸浮顆粒物(suspended particulate matter, SPM)作用形成油-顆粒物聚集體(oil-SPM aggregates, OSAs)。此外，消油劑還會對溢油的遷移及PAHs的生物降解產生影響。鄭關超等[9]研究了環渤海地區養殖水產品中PAHs污染殘留及健康風險的問題，發現該區域養殖水產品中PAHs污染狀況較為普遍，尤其是菲的平均含量及檢出率最高；還發現PAHs污染表現出一定的生物相關性。

菲是最具代表性的三環PAHs，其在石油中含量較高，而3-甲基菲是菲的烷基化衍生物，存在于煙氣之中[10]。蒽的9,10位比較活潑，很容易發生諸如溴化、醛化、溴甲基化等反應而與其他化合物作用形成功能材料[11]。9,10-甲基蒽多用于有機合成、染料制備。多環芳烴的化學性質與其結構相關，針對多環芳烴的結構特征，一些學者提出了“K區”理論和“L區”理論。具有3～4環的PAH，因分布廣泛、烷基大小、組成不同構成了一系列化合物，這類化合物的持久性可以導致慢性毒性的發生，并且可以小到被水生生物富集在組織體內[12]。3-甲基菲和9,10-甲基蒽是中國海洋溢油優先監測的16種多環芳烴(PAHs)中的2種。鮑魚作為北方地區具有極為重要經濟價值和食用價值的經濟動物，然而隨著海洋環境污染加重，鮑魚對PAHs的生物富集成為影響鮑魚生長發育和威脅人體健康的重要因素[13-14]。但是目前國內外對于PAHs在鮑魚體內富集過程研究較少。依據PAHs在海洋環境中的分布特征和海洋生物在海洋生態系統中的重要作用，本研究選擇皺紋盤鮑作為受試生物，開展了3-甲基菲和9,10-甲基蒽2種多環芳烴對鮑魚的毒性作用研究，以期為確定我國海洋環境多環芳烴的環境基準、保護海洋生態環境提供基礎數據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗用海水為來自大連黑石礁海域的砂濾海水，鹽度為30～31，pH為7.8～8.1，進行沙濾充分曝氣后使用。實驗用鮑魚苗，殼長(3±0.3) cm，購買自大連太平洋海珍品有限公司，于實驗室海水養殖循環系統中暫養1周后，選取健康的個體用于實驗。氣相色譜質譜聯用儀(GC6890N/MSD5975B, Agilent Co, USA)；加速溶劑提取儀(ASE350, Dionex Co, USA)；Heidolph旋轉蒸發儀(Hei-VAP, 德國)；所有試劑(正己烷、二氯甲烷、丙酮)均為農殘級，購自TEDIA公司，硅膠(0.100 mm)購自Merck公司，弗羅里硅土(Florsil, 60～100目)購自美國Floridin公司。內標(替代內標Z-014J：含菲-d10和芘-d12；進樣內標：三聯苯-d14)購自Wellington公司。3-甲基菲和9,10-甲基蒽是我國海洋溢油優先監測的幾種PAHs，在所有水產養殖海域監測中均有發現。因此選擇此2種PAHs作為研究對象。實驗用3-甲基菲和9,10-甲基蒽購買自Sigma公司(Sigma-Aldrich Corporation, USA)，純度分別大于97%和98%；使用丙酮(濃度為99.5%)作為助溶劑將2種PAHs配制成一定濃度的母液。

1.2 生物蓄積實驗

通過96 h急性毒性實驗得到2種PAHs 3-甲基菲和9,10-甲基蒽對鮑魚的半致死濃度LC50分別為653.7 μg·L-1和488.5 μg·L-1。以此為依據設置2種PAHs的生物蓄積實驗所需PAHs的濃度。3-甲基菲濃度分別為5、10、100 μg·L-1，9,10-甲基蒽的濃度分別為5、10、50 μg·L-1。另外設置1組海水對照組，1組丙酮對照組，丙酮濃度為所加入所有體系的最大量的0.01%。每組設置3個重復，每個1 L玻璃燒杯中放入鮑魚12只。試驗期間保持充氧，使水中溶解氧濃度保持6 mg·L-1以上，實驗水溫為18～20 ℃，每天定時投喂一次鮮海帶，投喂量為體質量(以第一次稱重為準)的1.5%。以此時為時間起始點，每天換一次新鮮海水，投加相應的污染物至所設置的濃度。取樣時間，自實驗開始第3、7、14天取樣，每次每個處理組取鮑魚3只，用錫箔紙包裹，放入-80 ℃冰箱保存待測。

1.3 樣品處理

本文對鮑魚體內3-甲基菲和9,10-甲基蒽的測定方法依據李天云等[15]對生物體內多環芳烴測定所采用的氣相色譜-質譜法。全量稱取冷凍干燥后的生物樣品，加入無水硫酸鈉和氘代回收率指示物(Z-014J, 10.0 μg·mL-1)用來控制樣品前處理的目標化合物的回收率，用100 mL正己烷和丙酮混合溶液(1:1,V:V)進行加速溶劑萃取，萃取溫度100 ℃，加熱時間5 min，靜態時間10 min，循環3次，沖洗體積60%，吹掃時間60 s。樣品提取液過無水硫酸鈉小柱，加鹽酸處理過的銅粉除硫：生物樣品提取液直接轉入潔凈的燒瓶中，加入一定量(視有機相的透明度而定)的酸性硅膠，磁力攪拌約0.5 h。去除脂肪等大分子雜質將萃取液濃縮至2.0 mL左右，濃縮液過佛羅里土(5.0 g)與硅膠(8.0 g)復合柱凈化，50 mL正己烷預淋洗，80 mL正己烷/二氯甲烷(1:1,V:V)淋洗液，接取淋洗液濃縮定容至200 μL，添加1 μL進樣內標(三聯苯-d14, 10.0 μg·mL-1)。上機測定，加入內標的作用為了消除系統誤差及定量目標化合物。樣品采用DB-5ms毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)進行氣相分離，采用EI源電離方式進行質譜檢測。色譜柱升溫程序為：50 ℃開始，不停留；以4 ℃·min-1升溫到220 ℃，停留3 min；以10 ℃·min-1升溫到300 ℃，停留9 min。載氣(氦氣)流速為1.0 mL·min-1，恒流，進樣口溫度280 ℃，無分流進樣，進樣量為1 μL；傳輸線溫度290 ℃，四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，離子掃描為SIM模式。

所有樣品和空白中標準替代內標3-甲基菲和9,10-甲基蒽回收率分別71.2%～83.9%和65.5%～88.3%，相對標準偏差分別為7.3%和6.7%，每個樣品3個平行測試。空白實驗結果顯示所有目標物低于方法檢測限，文中給出的數據均已經過回收率校準。

1.3.1 雙箱動力學模型

雙箱動力學模型是在近幾年發展起來的一類數學模型，主要用于重金屬、有機污染物的生物富集研究，它能較好地描述污染物在水體與生物體之間的作用過程，并能模擬出達到生物富集平衡情況下的動力學參數(圖1)。

圖1 生物富集雙箱動力學模型Fig. 1 Two-compartment kinetic model of bioconcentration

雙箱動力學模型生物富集公式為：

CA=C0+Cw×K1/K2×(1-e-K2t) (0

(1)

其中：CA為生物體中PAHs濃度(ng·g-1)；C0為實驗開始前生物體內PAHs濃度(ng·g-1)；K1為吸收速率常數，K2為釋放速率常數，Cw為水體中PAHs濃度(μg·L-1)，t*為富集天數。由方程(1)進行非線性擬合可得到K1、K2。

理論平衡狀態下BCF用公式(2)表示：

BCF=K1/K2=limCA/Cw(t→∞)

(2)

生物半衰期公式：

t1/2=ln2/K2

(3)

富集達到平衡時，生物體內PAHs含量Cmax用公式表示為:

Cmax=BCF×Cw

(4)

1.3.2 模型的擬合優度檢驗

應用MatLab2014A對數據進行非線性擬合，根據3個實驗濃度的生物富集量數據獲得3個方程(1)，以上3個方程(1)聯立，可得到K1、K2，結合判定系數R2來評價該模型的擬合優度，并采用F檢驗對模型整體的顯著性進行檢驗，以此驗證雙箱模型用于鮑魚對PAHs的生物富集研究的可行性。采用SSPS 13.0軟件(SPSS Inc.)對實驗數據進行方差分析和回歸分析。采用ANOVA方法分析PAHs暴露組與空白對照組之間的差異，P<0.05、P<0.01表示差異顯著。

2 結果(Results)

從圖2可知，空白對照組和丙酮對照組檢測出少量的9,10-甲基蒽，由于對照組并未加入該污染物，因此可以判定對照組中的9,10-甲基蒽來自環境本底值。隨著暴露時間的延長，9,10-甲基蒽在鮑魚體內的蓄積量也有所增長，說明鮑魚體內沒有或者有少部分代謝的途徑無法通過該途徑使9,10-甲基蒽代謝出體外。如表1所示，隨暴露時間的延長鮑魚體內的蓄積量越來越多，濃度為5 μg·L-1條件下，符合雙箱動力學模型，K1=1.494，K2=0.101，R2=0.977(95%置信區間)。9,10-甲基蒽在10 μg·L-1濃度條件下隨著暴露時間的延長，9,10-甲基蒽在鮑魚體內的蓄積量也有所增長，符合雙箱動力學模型，K1=3.906，K2=0.584，R2=0.760(95%置信區間)。在50 μg·L-1濃度下，9,10-甲基蒽在鮑魚體內的蓄積量隨時間一直增加，使用雙箱動力學模型進行擬合，K1=9.431，K2=0.533，R2=0.759(95%置信區間)。在5 μg·L-1和10 μg·L-1濃度下，3～14 d生物蓄積量之間差異不顯著(P<0.05)，認為在第3天達到富集平衡。

從圖3可知，在5 μg·L-1濃度的情況下鮑魚對于3-甲基菲富集第3天富集量與第14天富集量之間無顯著差異(P<0.05)，說明鮑魚對3-甲基菲富集在第3天達到了平衡。如表1所示，在5 μg·L-1濃度下，鮑魚符合雙箱動力學模型，K1=3.308，K2=0.462，R2=0.912(95%置信區間)。10 μg·L-1濃度下，隨著3-甲基菲濃度的升高，3-甲基菲在鮑魚體內的蓄積量明顯增加，其雙箱動力學模型參數分別為K1=3.061，K2=0.261，R2=0.994(95%置信區間)。在100 μg·L-1的濃度下，鮑魚體內3-甲基菲隨著暴露時間的延長蓄積量也有所增長。此濃度下K1=0.538，K2=0.377，R2=0.919(95%置信區間)。

圖2 9,10-甲基蒽在鮑魚體內富集過程Fig. 2 Enrichment of 9,10-dimethylanthracene in abalone Haliotis discus hannai

圖3 3-甲基菲在鮑魚體內富集過程Fig. 3 Enrichment process of 3-methylphenanthrene in abalone Haliotis discus hannai

表1 鮑魚對2種多環芳烴(PAHs)3 d、7 d和14 d的生物富集動力學參數Table 1 Bioaccumulation kinetic parameters of two polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) (3 d, 7 d and 14 d) with different concentrations of H. discus hannai

注：BCF表示生物富集因子，Cmax表示平衡狀態下鮑魚體內2種多環芳烴的含量，t1/2表示生物學半衰期。

Note: BCF represents biological enrichment factor;Cmaxrepresents the content of two polycyclic aromatic hydrocarbons in abalone at equilibrium;t1/2represents the biological half-life.

3 討論(Discussion)

PAHs一旦通過各種途徑進入水生生物體內，易積累于生物脂肪中，形成生物富集，對生物體造成巨大的傷害[16]。目前，有關PAHs的生態毒理學研究大部分涉及陸生動物和淡水生物[17-20]。李磊等[21]研究了苯并[a]芘、菲在縊蟶體內的富集情況，發現縊蟶對苯并[a]芘的富集能力高于菲；縊蟶對苯并[a]芘、菲的K1平均值分別為0.44、0.36，K2平均值分別為0.0016、0.0030，BCF平均值分別為268.18、118.57。K1、BCF均隨苯并[a]芘、菲暴露濃度的增大而減少。陳輝輝等[22]研究了PAHs對唐魚的急性毒性效應，發現菲和萘對唐魚96 h的LC50分別為0.913 mg·L-1和10.849 mg·L-1，其安全質量濃度分別為0.091 mg·L-1和1.085 mg·L-1。本研究表明，14 d內鮑魚體內吸收9,10-甲基蒽和3-甲基菲的濃度最大可達960.3 μg·L-1和600 μg·L-1，隨著PAHs濃度的增加，鮑魚對2種PAHs的生物富集量逐漸增加。鮑魚體內PAHs含量在前期增加迅速，隨后增加趨于平衡。與高萍等[23]對菲律賓蛤仔對石油烴的富集與釋放特征的研究一致。究其原因，生物體對有機污染物的吸收主要取決于其生物體體內脂肪與水體中有機物的比例[24-26]。實驗開始時鮑魚體內PAHs含量比較低，生物體開始大量吸收PAHs，污染物主要由水相向有機相遷移，即生物體體內脂肪對PAHs的吸附起主要作用，此時吸附速率K1高于釋放速率K2。經過一段時間富集以后，鮑魚體內PAHs逐漸趨于飽和，富集增加幅度減小。

與母體多環芳烴相比，烷基多環芳烴具有種類繁多，持久性更強的特點。在受石油污染的環境中，水生生物體內的烷基多環芳烴含量遠遠高于非烷基多環芳烴。在瓦德茲溢油事件中，當海水青鳉(Oryziasmelastigma)暴露在含有高濃度的烷基化合物中，死亡率、畸形率都明顯升高，說明烷基化合物對早期幼魚的發育影響占有主要地位[27]。

實驗由于使用了丙酮作為助溶劑提高了2種PAHs的水溶性，因此生物富集能力可能得到了進一步加強。鮑魚較其他水生生物相比，富集系數從大到小為：三疣梭子蟹>圓海鰺≈棱鯔≈鮑魚>鱸魚>河蜆[28-29]。鮑魚富集系數在1.05～19.21之間，屬于低富集能力，低代謝能力的生物，鮑魚對于多環芳烴富集系數隨時間和濃度呈指數增長。Cmax的范圍是75.7～960.3 μg·L-1，說明在不同PAHs濃度下生物體內達到富集平衡時的濃度是不同的。半衰期的不同也說明鮑魚對PAHs的代謝程度。由此推斷，在低濃度PAHs污染海域的鮑魚受到的影響可能并不嚴重。但如果是高濃度PAHs污染海域，鮑魚富集能力增強，且難以代謝，可能造成嚴重的后果。建議海洋環境管理部門加強對海洋環境中的16種優先監測PAHs的監測，及時對養殖環境質量狀況做出評價和預警；同時應加強入海排污總量的管理，嚴格控制石油類污染物的排放量，保護海洋環境特別是海珍品如鮑魚、海參、扇貝等養殖區水環境。

表2 文獻中水生生物對PAHs的生物富集系數Table 2 Literature data on BCF of PAHs for various aquatic organisms