食品微生物快速檢驗和無菌操作技術

司福龍

摘 ? 要：在食品質量檢驗過程中，要根據實際情況合理選用阻抗法、多聚酶鏈式反應技術、DNA芯片技術、ATP生物熒光技術、酶聯免疫吸附技術等進行食品微生物檢驗。在檢驗過程中，必須樹立無菌操作觀念，規范無菌操作程序，在取樣、樣品前處理、純種分離、革蘭氏染色等過程中嚴格遵守無菌操作技術，順利完成食品微生物檢驗工作，確保人群健康。

關鍵詞：微生物檢驗 ?食品檢驗 ?快速檢驗技術 ?無菌操作技術

中圖分類號：TS207 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：1674-098X（2019）02（a）-0125-02

食品微生物污染與人體健康息息相關，采用先進技術進行準確、有效的檢驗有利于維護人群健康。傳統微生物檢驗以染色、培養和生化鑒定等為主，結果比較可靠，為食品微生物檢驗的“金標準”。但細菌生長繁殖需要消耗一定時間，應及時檢測;同時病原體培養還與營養、抗生素使用和病原體含量等因素相關。隨著現代科學和物理化學、分子生物、免疫學等檢驗技術的不斷發展，快速微生物檢測技術被廣泛應用。無菌操作是微生物檢驗的重要環節，在食品微生物檢驗時，檢驗人員必須樹立無菌操作觀念，規范無菌操作程序，才能順利完成食品微生物檢驗工作。

1 ?食品微生物快速檢驗技術

1.1 阻抗法

微生物在培養基中生長繁殖會引起電特性變化，阻抗法是利用電變化特性來間接測定食品中微生物含量的一種檢測技術，能夠檢測食品中絕大部分食品微生物。微生物能將培養基中的惰性大分子營養素分解為具有微電活性小分子物質，根據不同生長期微生物濃度與培養基電阻性之間的線性關系，通過培養基電阻抗的檢測值可推算出食品樣本微生物的濃度。

1.2 多聚酶鏈式反應技術（PCR）

該技術的基本原理是通過體外酶促反應高效合成特異性的雙鏈DNA片斷，之后通過擴增產物識別不同的細菌，由于在體外完成DNA片段擴增，故又稱基因體外擴增法。

PCR技術具有較高的靈敏度，且耗費時間較短，理論上能檢出一個細菌的拷貝基因，通過PCR技術在短時間增菌甚或不增菌的情況下即可篩選檢測細菌。

PCR技術的缺點主要表現在：（1）出現假陰性結果。原因在于食物標本、增菌培養基和其他微生物DNA可能抑制Taq酶活性;（2）出現假陽性結果。PCR操作過程嚴格，微量外源性DNA混入食品樣本可得到無限放大;（3）影響檢測結果準確性，由擴增過程裝配誤差所致。

食品微生物檢測可應用PCR全自動檢測儀，這不僅可以克服手工操作的缺點，還能提高檢測結果的敏感性和特異性。

1.3 DNA芯片技術

基因芯片技術具有廣闊的發展前景和空間。生物芯片是基于玻片和尼龍膜等載體，有序排列很多生物活性分子。這些分子在單位面積上密度較高，在一次試驗下就能同時檢測多種食品樣本及其中的多種病原微生物。

根據芯片固定生物活性分子的不同，可分為蛋白芯片和基因芯片兩種類型，寡核苷酸探針或靶DNA為基因芯片的活性分子。與傳統的檢測方法相比，DNA芯片具有少樣品需求、可快速準確高效地顯示病原體遺傳信息，已被廣泛應用在分析宰基因序列、快速診斷病原微生物感染、研究變異和耐藥機制、揭示發病機制以及感染性疾病的診斷和治療等。

1.4 ATP生物熒光技術

ATP是一種高能磷酸化合物，含量相對穩定，普遍存在于各種細菌細胞中，并且是所有生物生命活動的最終能量來源。ATP生物熒光技術的原理是在熒光素酶的催化作用下，通過ATP激活熒光素并與氧結合，將化學能轉化為光能，釋放光量子。通過ATP不斷提供能量，不斷激活熒光分子，ATP濃度與發光強度呈線性關系。為降低外界干擾，增強特異性識別微生物能力，提高檢測靈敏度和檢測效率，應選取合適的ATP提取劑。

ATP生物熒光技術不需微生物培養，可在幾分鐘內得到檢測結果，普遍應用于肉制品雜菌污染鑒定、飲料和調味品微生物檢測等。

1.5 酶聯免疫吸附技術

該技術是應用最廣泛的酶免疫測定技術，其原理是在固相載體吸附抗原或抗體并行免疫酶染色，在酶作用下出現顯色反應，之后運用定性或定量方法分析有色產物量，進而確定樣品中待測物質的含量，是一種特異性和敏感性較高的食品微生物檢測方法。

雙抗體夾心法、間接法、捕獲法、競爭法是常用的酶聯免疫吸附技術，可用于檢測食品中沙門氏菌、大腸桿菌、彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌等微生物，檢測食品標本數量可達上千份，具有成本低、反應靈敏、適用范圍廣、定量和檢測速度快等優勢。

2 ?食品微生物檢驗的無菌操作技術

2.1 取樣

食品微生物檢驗是無菌稱取要求檢驗的樣本質量，取樣過程中要使用消毒天平，剪刀、藥匙等檢驗用品要經170℃/2h干熱滅菌。取樣過程要嚴格按照無菌操作技術，切實保證樣品原始狀態。

2.2 樣品前處理

取樣后要行樣品前處理，整個過程必須嚴格遵守無菌操作技術。一般稱取25g樣品于盛有225mL無菌稀釋液無菌均質袋中均質，制備成1：10樣品勻液進行檢驗。對計數樣品要制備10倍系列稀釋樣品勻液，按照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗 菌落總數測定》（GB4789.2-2016）要求完成樣品前處理操作。

2.3 純種分離

為準確確定食品標本微生物群體，檢驗時要從混雜樣品中分離出疑似目標菌，進而得到純培養物。為促進目標微生物生長繁殖，要根據微生物不同特性針對性選擇培養基并設定適宜培養條件;或通過應用相應抑制素，抑制除目標菌以外的雜菌生長繁殖，進而淘汰其他雜菌，進而將培養物接種在固體培養基上形成目標菌的單菌落。按要求純化與鑒定單菌落，保證分離到純菌株。

在整個分離純化過程中，通常需要用接種環把微生物的純培養物從一個器皿轉接到另一個器皿中培養。如此時未嚴格遵守無菌操作技術，很難保證檢驗結果的準確性。同時，檢驗人員應加強自身實驗水平與操作能力，確保無菌操作技術熟練準確，不斷提高自身綜合能力。

2.4 革蘭氏染色

革蘭氏染色是食品微生物確認鑒定的重要方法，將疑似目標菌經過純化分離后染色，在光學顯微鏡下觀察微生物形態，能初步鑒定微生物是否為所檢驗目標菌。涂片—初染—媒染—脫色—復染為革蘭氏染色的操作步驟，涂片是最重要最關鍵的步驟，涂片過程中必須嚴格無菌操作技術，避免混入雜菌，影響鏡檢結果。

2.5 空白對照

按照GB4789.2-2016要求，在有營養瓊脂培養基的滅菌培養皿中加入1mL空白稀釋液作為空白對照，這是保證檢驗結果真實有效的關鍵措施。

空白對照結果可直接反映檢驗用品、無菌室空氣條件和操作人員是否符合無菌操作的要求，即檢驗過程中所使用檢驗用品是否已徹底滅菌、無菌室空氣條件是否滿足既定標準、操作人員是否規范完成無菌操作技術。只有空白對照結果符合要求，才能獲得可靠有效的檢驗結果。

綜上所述，在食品質量檢驗過程中，要根據實際情況合理選用阻抗法、多聚酶鏈式反應技術、DNA芯片技術、ATP生物熒光技術、酶聯免疫吸附技術等進行食品微生物檢驗。在檢驗過程中，必須樹立無菌操作觀念，規范無菌操作程序，在取樣、樣品前處理、純種分離、革蘭氏染色等過程中嚴格遵守無菌操作技術，順利完成食品微生物檢驗工作，確保人群健康。

參考文獻

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