PCR-熒光探針法檢測MTHFR C677T基因多態性及其與復發性流產的相關性

白 微 唐少華

( 溫州醫科大學 溫州 325000)

復發性流產(recurrent spontaneous abortion,RSA)，是指自然流產連續2次或2次以上，在全世界范圍內其發生率為1%～2%，在中國其發生率高達5%。復發性流產的病因復雜，包括遺產因素、生殖道解剖異常、免疫因素、內分泌因素、感染因素等，還有部分原因不明。

5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetra hydrofolate reducta，MTHFR)是葉酸代謝中的一個重要的酶，可將5,10-亞甲基四氫葉酸轉化為具有生物學功能的5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸通過同型半胱氨酸的重新甲基化過程，間接為DNA甲基化和蛋白質甲基化提供甲基，并且使血液中的同型半胱氨酸水平保持在一個較低的水平。MTHFR的突變會引起一系列的病理變化，現已證實與神經管畸形、唇腭裂、先天性心臟病、妊娠期高血壓等密切相關。國內外皆有MTHFR C677T與復發性流產的相關性報道，但兩者的相關性存在較大的爭議。目前MTHFR基因多態性的檢測方法主要有聚合酶鏈反應-限制性酶切片段長度多態性(PCR-RFLP)、高分辨溶解曲線突變檢測(HRM)和二代測序等，PCR-熒光探針法具有靈敏度高、結果準確的優點，檢測MTHFR具有優越性。

本文旨在簡要評價PCR-熒光檢測MTHFR的性能，探討溫州地區復發性流產與MTHFR的相關性。

1 資料與方法

1.1 資料來源

收集2015年6月～2016年6月我院中醫婦科保胎住院患者188 例，排除染色體異常、內分泌疾病、解剖結構異常、人工受精等。根據自然流產病史，連續自然流產2次及以上為實驗組即RSA組，無自然流產史及無其他不良妊娠史且生育過健孩為對照組。RSA組年齡(31.46±4.64)歲，對照組年齡(31.33±4.46)歲，兩組年齡差異無統計學意義(F=0.027，P=0.869)。所有患者均簽署知情同意書，本研究獲得溫州市醫科大學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1PCR-熒光探針法檢測MTHFR C677T 基因多態性

采集EDTA抗凝的外周靜脈血2ml，提取全血的全基因DNA，借助PCR-熒光探針技術，利用探針可與DNA模板特異性結合的特點，通過報告熒光的不同來分辨出樣本的基因型。試劑盒購自深圳奧薩醫療有限公司。

1.2.2測序法檢測MTHFR C677T 基因多態性

選取20例不同基因型的樣本，送第三方機構進行全基因測序。

1.2.3統計方法

2 結果

2.1 PCR-熒光探針法的性能評價

2.1.1最低檢測限

最低檢測限為200pg/ul，有文獻報道[1]最低檢測限5.0ng/ul可作為臨床應用，本試劑盒最低檢測限適應臨床需求。

2.1.2準確性

以測序法作為金標準，檢測結果見表1。經Kappa檢驗，Kappa值=1.0，說明兩種方法具有完全一致性。

表1 兩種檢測方法檢測結果

基因型CCCTTTCC800CT0100TT002

2.2 H-W平衡檢驗

MTHFR有三種基因型：CC基因型、CT基因型、TT基因型。經過Hard-Weinberg平衡分析，對照組(χ2=0.005，P=0.997)和RSA組(χ2=1.624，P=0.444)兩組人群處于均處于H-W平衡狀態，樣本具有本區域群體代表性。

2.3 MTHFR C677T基因型及等位基因頻率分布

三種基因型及等位基因在對照組中的分布頻率分別為CC(41.4%)、CT(46.5%)、TT(12.1%)和C(65.7%)、T(32.3%)；在RSA組中的分布頻率分別為CC(37.5%)、CT(38.9%)、TT(23.6%)和C(56.9%)、T(43.1%)。兩組中的分布差異無統計學意義，見表2。

表2 基因型及等位基因分布頻率[n(%)]

基因型等位基因CCCTTTCT對照組48(41.4)54(46.5)14(12.1)15(65.7)82(32.3)RSA組27(37.5)28(38.9)17(23.6)82(56.9)62(43.1)χ2/P4.355/0.1132.236/0.135

3 討論

MTHFR是位于第一號染色體1p36.3位置。MTHFR全長20.374 kb，共有外顯子12個，mRNA全長7,150 bp。目前該基因中研究較為透徹的多態性位點是第五外顯子677位的C/T多態。目前MTHFR 基因多態性的檢測方法主要有聚合酶鏈反應-限制性酶切片段長度多態性(PCR-RFLP)、高分辨溶解曲線突變檢測(HRM)和二代測序等，PCR-熒光探針法特異性高，方法靈敏，封閉管分析可有效避免污染。本研究使用PCR-熒光探針法和測序法同時檢測了20例樣本，CC型的符合率100%，CT型的符合率100%，TT型的符合率100%,Kappa值=1，兩種方法表現出了完全的一致性，說明PCR-熒光探針法具有高準確度。

該位點的突變引起酶活性的下降或缺失，使血漿中同型半胱氨酸濃度升高，從而導致高同型半胱氨酸血癥，造成血管內皮損傷及血栓形成，而血液高凝狀態是胎盤動脈栓塞形成的內在原因，同時高同型半胱氨酸對胚胎有毒性作用，可能與復發性流產有關[2]。國內有學者[3]對相關文獻進行Meta分析顯示，基因型為CT或TT的女性發生RSA的風險較CC者分別高出93%和22%。王賢軍等人[4]研究了杭州地區RSA的情況，分析得出，攜帶TT基因型的女性發生RSA的風險是正常女性的2.344倍。國外學者Manju[5]和Ahmad[6]等人分別對北印度和伊朗RSA婦女研究發現，MTHFR C677T 基因多態性在病例組和對照組中的分布無差異。Baumann等[7]以高加索人為研究對象，認為MTHTFR C677T 多態性可能是RSA的病理生理機制。

本研究未發現MTHFR C677T 基因多態性與RSA存在相關性。TT基因型和T等位基因在RSA組的分布頻率較對照組增高，但其差異無統計學意義。本研究的結果與上述王賢軍等人的研究結果不一致，與Manju和Ahmad等人的結果相一致。究其原因，MTHFR的分布受人種、地域影響，例如中國人群中TT基因型頻率約為20%，而在非洲撒哈拉地區黑人種未發現有TT純合突變[8]；RSA的影響因素包括環境因素，生活習慣因素等；另外，研究的樣本大小、研究方法的不同亦造成研究結果的差異。

復發性流產在妊娠婦女中的發生率日益增高，雖本次研究顯示其與MTHFR C677T基因多態性的相關性較小，但兩者之間的相關性從其他角度，如RSA婦女再妊娠的妊娠結局、早產兒、低體重胎兒等的關系值得深入研究。