乳桿菌發酵鱘魚骨酶解液條件優化及營養成分分析

武瑞赟，杜怡麗，張金蘭，尹 劍，胡錦蓉，李平蘭*

（北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

魚骨中富含鈣、蛋白質以及礦質元素[1]，是營養豐富的天然資源，但由于鈣和蛋白質分別以結合態形式[2]和三螺旋結構的骨膠原形式[3]存在，均很難被機體吸收利用。酶解是提高蛋白質功能特性的手段之一[4]，骨膠原在蛋白酶作用下降解為肽和少量氨基酸[5-6]，具有抗氧化、降血糖[7-8]等生理功能。通常鈣是在小腸部位以可溶性鈣離子的方式吸收利用的[9]，而單純的酶解并不能使魚骨中以羥基磷灰石Ca10(PO4)6OH結合態存在的鈣完全轉化為游離態，導致魚骨中大量的鈣仍不能夠被利用。研究發現，發酵可以使羥磷石灰鈣轉變為易于吸收的離子鈣[10]，因此，采用酶解與發酵相結合的手段可以進一步提高魚骨的營養價值和利用率。

常用的發酵劑有酵母菌、葡萄球菌、微球菌以及乳酸菌[11]等，其中乳酸菌種類較多，發酵過程產酸[12]，有調節人體腸道微環境、促進營養物質吸收、增強抵抗力、抗腫瘤[13-15]等功能。研究發現，乳酸菌能夠利用肽[16]、氨基酸為氮源生長[17]，所以酶解液可以為乳酸菌的生長提供天然底物，同時發酵過程中產生的酸性環境為骨中鈣由結合態分解為游離態提供了條件；微生物分泌的蛋白酶和肽酶[18-19]又可進一步將長鏈肽水解為短肽，一些短肽可以與鈣、鎂等離子形成螯合物[20-21]，有利于機體的吸收，提高生物利用率。

L-ZS9是本實驗室從比利時發酵肉制品Saucisson sec pur中分離得到的1 株類植物乳桿菌（Lactobacillus paraplantarum），是國內首個在GenBank上提交全基因序列的類植物乳桿菌[22]。前期研究發現，該菌株生長速度快，產酸能力強，與腸細胞有很好的黏附作用，并可產生雙肽細菌素（IIb類）[23-24]，具有良好的競爭優勢。同時，該菌株還存在調控生物被膜形成的LuxS/AI-2群體感應系統[25-26]，有利于菌株耐受消化道環境及在腸道內黏附定植，顯示出具有開發成為益生菌產品或發酵劑的潛力。

目前，國內外利用乳酸菌發酵骨粉酶解液的相關研究很少，本研究以鱘魚軟骨酶解液為材料，類植物乳桿菌L-ZS9為發酵劑，通過單因素試驗及響應面法優化適合類植物乳桿菌L-ZS9生長的最佳發酵條件，同時考察發酵對酶解液中鈣、鎂、磷等營養成分的影響，為開發富含益生菌及多種營養成分的新型骨產品提供技術支撐，同時為禽畜骨的高值利用和新產品開發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱘魚由北京市農科院水產所十渡鱘魚繁育基地提供，為史氏鱘和西伯利亞鱘雜交品種；類植物乳桿菌L-ZS9，由本實驗室分離并保存。

MRS肉湯培養基 北京奧博星生物技術有限公司；瓊脂 寶如億（北京）生物技術有限公司；葡萄糖 西隴科學股份有限公司；氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）北京化工廠；鈣試劑盒、磷試劑盒、鎂試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

LGJ-12冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；FA1004電子分析天平 上海天平儀器廠；UV-1800紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器術有限公司；MET-30033757 pH計 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Sorvall Legend Micro 17微量臺式離心機 賽默飛世爾科技公司；HZQ-F160全溫振蕩培養箱 蘇州培英實驗設備有限公司；YXQ-LS-SII全自動立式蒸汽滅菌鍋 上海博迅實業有限公司；DK-8B電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；DW-86W100超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；FEI Quanta 200環境掃描電子顯微鏡 美國菲達康有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 鱘魚軟骨粉酶解液的制備

依據實驗室前期的實驗所得的條件，以料液比1∶25（g/mL），使用堿性蛋白酶與中性蛋白酶以3%加酶量2∶1混合，55 ℃酶解5 h可得到蛋白水解度較高的鱘魚軟骨粉酶解液。

1.3.2 菌株活化與保存

取適量實驗室保藏的類植物乳桿菌L-ZS9凍干粉溶解于0.85%生理鹽水中得菌液，取菌液接種于無菌MRS肉湯培養基，37 ℃恒溫搖床培養24 h。連續接種3 代，每一代劃平板培養觀察菌落形態，同時取菌液涂片固定，進行革蘭氏染色，100 倍油鏡觀察菌體特征，確保操作無污染。連續接種3 代至菌株活力正常，轉接于磁珠菌種保存管，－80 ℃保存備用。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 發酵時間的選擇

以3%接種量將活化后菌株接種于初始pH 6.5的無菌鱘魚軟骨粉酶解液培養基中，37 ℃培養0、12、24、36、48、60 h取樣，取適宜的3 個稀釋度各倒3 個平行平板菌落計數。

1.3.3.2 接種量的選擇

分別以2%、3%、4%、5%、6%不同接種量將活化后菌株接種于初始pH 6.5的無菌鱘魚軟骨粉酶解液培養基中，37 ℃培養24 h，取適宜的3 個稀釋度各倒3 個平行平板菌落計數。

1.3.3.3 發酵起始pH值的選擇

以4%接種量將活化后菌株接種于起始pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的無菌鱘魚軟骨粉酶解液培養基中，37 ℃培養24 h，平板菌落計數。

1.3.3.4 葡萄糖添加量的選擇

以4%接種量將活化后菌株接種于滅菌前分別添加0、10、20、30 g/L和40 g/L葡萄糖，初始pH 6.0的無菌鱘魚軟骨粉酶解液培養基中，37 ℃培養24 h，平板菌落計數。

1.3.4 響應面試驗設計

利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken模型，選擇發酵液中活菌數（Y）為響應值，進行發酵時間（A）、葡萄糖添加量（B）、發酵起始pH值（C）、接種量（D）4 個因素對發酵液活菌數的響應面分析，優化4 個因素的最優水平組合。響應面試驗設計因素與水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used for response surface d esiiggnn

1.3.5 乳酸菌活菌數的測定

發酵液中活菌數按GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》中的方法測定。

1.3.6 掃描電鏡觀察骨粉微觀結構變化

將酶解后及發酵后的鱘魚軟骨粉樣品用1 mL戊二醛固定，真空噴金2 次各60 s達到厚度為10 nm成像，使用FEI Quanta 200型環境掃描電鏡對樣品進行顯微結構觀察。

1.3.7 營養成分測定

可溶性鈣含量由鈣試劑盒微孔板法測定；可溶性磷含量由磷試劑盒微孔板法測定；可溶性鎂含量由鎂試劑盒微孔板法測定；可溶性蛋白質含量利用BCA蛋白定量試劑盒測定。

1.4 數據處理

所得數據均為平行測定3 次以上取平均值，并計算出正負標準偏差，用誤差線表示。采用Design-Export 8.0.6數據處理軟件對實驗結果進行處理，應用中心點法對各組變量的計算結果進行方差分析和差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

選取對發酵液活菌數影響顯著（P＜0.05）且貢獻值最高的發酵時間、接種量、起始pH值及葡萄糖添加量4因素進行單因素試驗，結果見圖1。

圖1 發酵時間（A）、葡萄糖添加量（B）、發酵起始pH值（C）、接種量（D）對活菌數的影響Fig. 1 Effects of fermentation time (A), glucose addition (B), initial pH (C),inoculum size (D) on the number of live bacteria

由圖1可知，隨發酵時間、接種量、起始pH值及葡萄糖添加量的增加，活菌數都呈先增加后下降的趨勢，其中發酵時間為24 h時，活菌數達到最大值9.50×106CFU/mL，24 h之后，由于發酵液中的碳源、氮源等營養物質的減少，以及菌體自身可能進入衰亡期，使得活菌數有所下降（圖1A）；圖1B顯示，將葡萄糖添加量范圍控制在0～40 g/L之間，發酵24 h時，活菌數結果顯示在20 g/L得到活菌數值最大為2.34×107CFU/mL。在固定發酵時間24 h、葡萄糖添加量20 g/L的情況下，圖1C顯示，發酵起始pH 6.0時，活菌數達最大值為5.01×107CFU/mL。固定以上因素，由圖1D可知，在接種量為4%時，活菌數達最大值8.37×108CFU/mL，隨著接種量的增加，活菌數有所下降，可能是由于培養基營養成分的局限性，不能供給微生物更多的營養，微生物生長受到限制，活菌數有所下降。另外，考慮到過高的接種量對發酵體系物質消耗的因素以及菌體自溶帶來的影響，確定4%為適宜接種量；通過單因素試驗得到的最適發酵時間、接種量、起始pH值及葡萄糖添加量分別為24 h、4%、6.0和20 g/L。

2.2 Box-Behnken響應面試驗結果

2.2.1 響應面優化的試驗方案及結果

利用Design-Expert 8.0.6軟件設計Box-Behnken模型，共得到29 個試驗組，并按照方案進行試驗，以活菌數為響應值（Y），試驗方案及結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

2.2.2 響應面模型方差分析

根據試驗結果建立回歸模型并進行方差分析，如表3所示。

表3 響應面試驗回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

由表3可知，所選模型P值小于0.000 1，高度顯著，說明與實際情況擬合良好；失擬項P值大于0.05，不顯著，說明未知因素對試驗結果干擾小，模型選擇適當。同時，該模型的決定系數為0.936 1，說明該方程與實際情況擬合良好，較好地反映了發酵液中活菌數與發酵時間、接種量、發酵起始pH值和葡萄糖添加量之間的相互作用關系，因此該模型可用。利用Design-Expert 8.0.6對表3所顯示的結果進行二次多元擬合處理，得到發酵液中活菌數（Y）對發酵時間（A）、葡萄糖添加量（B）、發酵起始pH值（C）和接種量（D）的二次多元回歸方程為：Y=8.28－0.10A－0.067B－0.027C+0.083D－0.004 17AB+0.008 51AC+0.00322AD+0.013BC+0.042BD+0.010CD－0.15A2－0.097B2－0.14C2－0.13D2。

圖2 各因素交互作用響應面和等高線圖Fig. 2 Response surface and contour plots showing the interactive effect of variables on L. paraplantarum growth

所得二次回歸方程的響應面圖和等高線見圖2，通過方程可知，二次項系數為負值，表明方程具有最大值。得到等高線呈橢圓狀，拋物面朝下，說明模型存在最大值，模型建立良好。軟件分析得到最優工藝為發酵時間20.07 h、葡萄糖添加量17.11 g/L、發酵起始pH 5.95、接種量4.27%，并預測在此條件下活菌數為2.09×108CFU/mL，按照此工藝進行驗證實驗，所得結果為3.55×108CFU/mL，與預測值基本吻合，說明模型很好地預測了實驗結果。

2.3 掃描電鏡觀察發酵前后鱘魚骨粉酶解液的微觀結構變化

圖3 酶解（a）及發酵后（b）鱘魚軟骨粉電鏡形態圖（×30 000）Fig. 3 Morphology of sturgeon cartilage powder after enzymatic hydrolysis (a) and fermentation (b)

圖3a是酶解后的鱘魚軟骨粉，其邊緣銳利，整體結構疏松分散，這可能是由于蛋白酶水解了骨粉中結構蛋白，導致骨的內部結構分離，呈現松散狀態，這與秦娜娜等[27]探究木瓜蛋白酶水解骨粉最佳工藝條件時得到的骨粉粒徑明顯小于未酶解前的骨粉粒徑的結果一致。發酵后的鱘魚軟骨粉（圖3b）表面呈多孔狀，致密結構被破壞，同時可見骨粉中活菌含量豐富。發酵后骨粉結構與劉麗莉等[28]對牛骨粉發酵前后的電鏡觀察所發現的結果相似，對比發現發酵過程對鱘魚骨粉顆粒表面的微觀結構影響顯著，與未經發酵的鱘魚軟骨酶解粉的完整結構相比較，推測發酵過程促使骨粉表面發生“侵蝕”的原因，主要是由于菌體代謝產生胞外膠原蛋白酶降解了骨中的膠原蛋白，從而破壞了骨的完整結構，使結合緊密的骨粉顆粒變得疏松，骨中的膠原蛋白肽更好地溶出，發酵液中氮源更加充足，這也為類植物乳桿菌L-ZS9的生長提供了營養支持，起到促生長作用。

2.4 鱘魚骨酶解液發酵前后營養成分

發酵前后功能成分及一般營養成分測定結果見表4。經測定，該產品活菌數可達（3.55±0.10）×108CFU/mL，滿足益生菌在人體內發揮益生作用活菌數108～109CFU/mL的要求[29]。

表4 鱘魚骨酶解液發酵前后營養成分測定結果Table 4 Changes in macronutrients of the hydrolysate before and after fermentation

鈣、磷、鎂是人體的重要組成物質，具有廣泛的生理功能，由于日常生活的磷攝入過多，過多的磷經過會帶體內的鈣分子排出體外，造成缺鈣現象的發生；鎂是骨骼中鈣進入血液的控制開關，單獨攝取鈣質可能造成鎂的缺乏，同時，鎂又可以與體內的游離鈣結合，鈣、磷、鎂比例適宜，才更有利于人體消化吸收[30-31]，達到補鈣的目的。可溶性蛋白指可以以小分子狀態溶于水或其他溶劑的蛋白，通常在微生物、食品加工等中作為重要指標，是重要的滲透調節物質和營養物質，具有提高細胞的保水能力、保護細胞及生物膜的作用。因此本研究對酶解液和發酵液中可溶性的鈣、鎂、磷以及可溶性蛋白質進行了營養指標測定。

如表4所示，發酵液中游離鈣、鱗、鎂含量較骨粉酶解液原料均有提高。說明在L-ZS9發酵過程中，代謝產物中的蛋白酶系進一步使酶解液中蛋白發生降解，使得一部分蛋白質溶出，可溶性蛋白含量略有所增加。也可以改變骨的結構，使更多的鈣流出，同時發酵產酸，提供酸性環境，骨中的羥磷灰石態鈣變成可溶的游離鈣釋放出來。同時發酵液中的鈣、磷、鎂約為4∶2∶1，符合中國營養學會提出的膳食鈣磷鎂比例，由此可見，利用類植物乳桿菌L-ZS9發酵鱘魚軟骨酶解液，可制得含益生菌的發酵魚骨類補鈣產品。

3 結 論

在單因素試驗的基礎上，設計響應面試驗，優化出乳桿菌發酵鱘魚骨酶解液的最佳工藝參數為發酵時間20.07 h、葡萄糖添加量17.11 g/L、發酵起始pH 5.95、接種量4.27%，在此條件下發酵液中乳桿菌活菌數可達（3.55±0.10）×108CFU/mL。同時，乳桿菌的發酵可顯著提高鱘魚骨酶解液中游離鈣含量。本研究利用類植物乳桿菌L-ZS9對鱘魚骨酶解液進行發酵，使其兼具了益生、補鈣的特性，實現了魚骨的高值利用，為相關功能產品的研發提供理論支持。