基于近紅外光譜的大鯢肉粉摻偽鑒別及純度檢測

楊 慧，陳德經,,*，夏冬輝，辛 茜，陳海濤，金文剛

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001；3.陜西理工大學化學與環境科學學院，陜西 漢中 723001；4.漢中龍鯢生物工程股份有限公司，陜西 漢中 723001）

大鯢（Andrias davidianus），俗稱“娃娃魚”，屬有尾目，隱鰓鯢科，是現存個體最大的兩棲動物，有“生物界活化石”的美稱[1]。大鯢被列入人工繁育國家重點保護水生野生動物名錄，農業部批準人工繁育養殖的子二代大鯢可加工利用[2]。大鯢具有很高的食用和藥用價值，黃世英等[3]對人工養殖的大鯢肉營養成分分析表明，大鯢肉蛋白質含量高，必需氨基酸、鮮味氨基酸含量豐富，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值高達3.15，遠高于雞蛋、豬肉、蝦。劉紹等[4]分析了大鯢肌肉中必需脂肪酸，主要為亞油酸、亞麻酸、DHA、花生四烯酸。此外，大鯢肌肉中含有鈣、鐵、鋅、硒等礦質物質，其中鋅含量遠高于魚、蝦、蟹、貝類等[5]。現代醫學認為，經常食用大鯢肉可以益智、延緩衰老、提高造血和免疫功能，對心腦血管疾病、惡性貧血、惡性腫瘤、癌癥等有很好的預防作用。曹潔等[6]研究了大鯢肉粉對小鼠免疫功能和抗疲勞作用的影響，表明大鯢肉粉具有增強小鼠免疫力和抗疲勞的功能。此外，大鯢體內含金屬硫蛋白，能清除人體自由基和重金屬離子，具有很好的解毒作用[7-8]。

大鯢肉粉是大鯢保健品的原料之一。目前，市場售賣的活體大鯢約50～100 元/斤，將其加工成大鯢肉粉其價格將翻幾番，有不法商販為牟取暴利，會在大鯢肉粉中摻入與其顏色較接近的低價位肉類和其他物質，如魚粉、淀粉等。這不僅損害消費者的利益，同時也擾亂了大鯢市場的健康發展。因此，建立一種快速識別摻偽大鯢肉粉的方法就顯得尤為重要。傳統肉類摻偽鑒別常用方法有感官檢驗法[9]、生物技術法[10]、光譜法[11]和電子感官鑒別技術（電子鼻和電子舌）[12]等，但這些方法存在耗時長、分析過程繁瑣、重現性差且成本高等缺點。近年來，近紅外光譜技術因具快捷、簡便、無損且重復性好等優點[13]，已廣泛應用于農畜產品[14]、果蔬[15]、乳制品[16]、油脂品[17]和肉制品摻偽鑒別中。張麗華等[18]采用近紅外光譜結合支持向量機模型對牛肉中摻雜鴨肉進行鑒別，其建模集正確率為97.09%，檢驗集正確率為94%。牛小穎等[19]采用近紅外光譜結合化學計量法鑒別了驢肉摻偽，校正集和預測集的判別正確率均為100%。Morsy等[20]采用近紅外光譜技術對新鮮及冷凍碎牛肉中摻雜豬肉、修剪脂肪、內臟等進行了鑒別，其所建模型的識別正確率高達100%。目前鮮見近紅外鑒別大鯢肉粉的相關文獻。

偏最小二乘（partial least square，PLS）法是目前近紅外光譜分析中應用最廣泛的數據建模方法，其可以綜合篩選光譜數據，提取信息變量[21]。其中，偏最小二乘-判別分析（partial least square-discriminant analysis，PLS-DA）法[22]和偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）分析法[23]分別用于判別分析和定量校正。

本實驗以大鯢肉粉為研究對象，分別摻入不同比例的草魚肉粉、江團魚肉粉和土豆淀粉，探索采用PLS法定性定量分析摻偽大鯢肉粉的可行性，以期為摻偽大鯢肉粉的快速檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大鯢肉樣 漢中龍鯢生物工程股份有限公司；草魚、江團魚 漢中當地水產店；土豆淀粉 自制。

1.2 儀器與設備

VERTEX 70紅外光譜儀（配備OPUS 7.5光譜采集軟件和漫反射積分球附件） 德國布魯克有限公司；LGJ-10B冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司；BCD-486WDEG冰箱 青島海爾股份有限公司；XH-D旋渦混合器 上海利聞科學儀器有限公司；DFY-1000搖擺式高速萬能粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；ME104E電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

大鯢肉樣、江團魚肉樣和草魚肉樣經液氮速凍、粉碎后置于冷凍干燥機中干燥，研磨，過60 目篩，得到細粉。然后在大鯢肉粉中分別摻入質量分數為1%～40%（1%、2%、3%…40%）的江團魚肉粉（n=40）、草魚肉粉（n=40）和土豆淀粉（n=40），保持混合樣總量為0.300 g，置于2 mL的離心管中，旋渦混合器上混勻。

1.3.2 光譜采集

將樣品放入石英杯中混合均勻，以儀器內置背景為參比，采用積分球漫反射方式采集樣品（40 個大鯢純肉樣、40 個大鯢摻江團魚肉樣、40 個大鯢摻草魚肉樣和40 個大鯢摻土豆淀粉樣）的近紅外光譜圖，掃描范圍4 000～10 000 cm－1，分辨率8 cm－1，累計掃描次數64 次，每個樣本重復掃描3 次，用于后續分析。

1.4 數據處理方法

對采集的160 個光譜進行2分類和4分類的分類建模分析，每類隨機選擇80%的樣本作為校正集，用于建立PLS-DA模型；每類剩余20%的樣本作為測試集，用于驗證模型的預測能力。對原始光譜經多元散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、標準正態變換（standard normal variate transformation，SNV）和一階導數（1st derivative，1SGD）、1SGD+MSC、1SGD+SNV等光譜預處理后，對所建判別模型的預測效果進行評價。

同時，為快速檢測摻偽樣的純度，采用PLSR分析法分別建立3 類摻偽樣中的大鯢肉粉的質量分數的定量校正模型。3 類摻偽樣定量模型中，每類分別隨機選取70%的樣本（28 個樣本）為校正集，用于建立定量校正模型，其余30%的樣本（12 個樣本）為測試集，用于驗證模型的預測性能。以校正集的10-折交互驗證誤差均方根（root mean squares error of cross-validation，RMSECV）確定建模的主因子數，以校正集的均方根誤差（root mean square for calibration，RMSEC）和校正集相關系數（R2c）為指標優化模型參數，以測試集的均方根誤差（root mean square for prediction，RMSEP）和測試集的相關系數（Rp2）考察模型的預測性能。

在Matlab R2014a環境下，采用PLS tool box 5.5程序進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 近紅外光譜圖

2.1.1 大鯢純樣和摻偽物近紅外光譜圖

由圖1可知，大鯢純肉樣的近紅外光譜曲線形狀相似，選取的40 條大鯢制備的肉粉差異不大。該批次的大鯢魚苗均購置于同一養殖戶，其種齡、生長環境、飼養環境完全相同，說明商品大鯢制備的肉粉無差異。近紅外光譜主要反映的是含氫元素的化學基團分子振動的倍頻和合頻吸收信息[24]，大鯢純肉粉的光譜在8 408、5 761、6 606、4 350 cm－1和4 047 cm－1附近有特征吸收峰。8 408、5 761 cm－1是C—H伸縮振動的二級倍頻，6 606 cm－1是O—H伸縮振動的二級倍頻，4 597 cm－1是N—H伸縮振動和N—H變角振動的組頻，4350 cm－1是O—H伸縮振動和O—H變角振動的組頻，4 047 cm－1是C—H伸縮振動和C—H變角振動的組頻[25]。

圖1 大鯢純肉樣的近紅外光譜圖Fig. 1 Near-infrared spectra of pure Chinese giant salamander meat samples

圖2 4 種純樣的平均光譜圖Fig. 2 Average spectra of four pure samples

由圖2可知，土豆淀粉的近紅外圖譜和其他肉類的圖譜有顯著差異，純江團肉粉、純草魚肉粉純和大鯢肉粉的近紅外光譜圖形狀極為相似，這可能是因為它們都以蛋白質物質為主。在波數為8 700～6 500 cm－1、5 000～4 000 cm－1范圍內，可用肉眼識別3 種純肉樣的光譜圖，且江團魚粉的吸光度最大的，大鯢肉粉的吸光度最低。肉類品種不同，其所含有的化學成分也不同，因此表現出不同的近紅外光譜吸收值，這也是近紅外技術應用于肉類摻假檢驗的基本原理[26]。土豆淀粉是一種多糖，其組成成分與肉制品有顯著差異，因此在4 000～7 000 cm－1波數范圍內，肉眼可直接識別純大鯢肉粉和純土豆淀粉。

2.1.2 摻偽大鯢肉粉的近紅外光譜圖

圖3 大鯢肉粉摻偽近紅外光譜圖Fig. 3 Near infrared spectra of adulterated Chinese giant salamander meat powder

比較圖2與圖3可以看出，大鯢肉粉摻偽光譜圖出現譜峰重疊現象，且隨著摻假物質量分數（從下到上遞增）的不斷增加，重疊現象隨之加重，很難用肉眼直接區分大鯢純肉樣和大鯢摻偽樣，此時就需要結合化學計量學方法進行數據分析。

2.2 定性分析結果

表1 不同光譜預處理方法所建摻偽大鯢肉粉PLS-DA（2分類）模型判別結果Table 1 Discrimination of adulterated and authentic samples by PLS-DA models with different spectral pretreatments

近紅外光譜建模分析時，其譜圖中的噪音、基線漂移、光散射等現象會影響模型的性能，因此需要對原始光譜預處理，以提高模型準確性[24]。目前，有許多預處理方法可用于近紅外光譜數據的處理[27]。在確定具體方法或組合方式前，很難確定最佳的光譜預處理方法[28-29]。近年來，有人提出了基于實驗設計的方法解決這一問題[30-31]，但仍有不足之處。因此，試錯法仍然是目前最常用的方法。本實驗采用MSC、SNV、1SGD、1SGD+MSC和1SGD+SNV五種光譜預處理方法。光譜預處理后，采用PLS-DA方法分別建立2分類和4分類的分類判別模型，以此確定最佳的光譜預處理方法。

由表1可看出，模型預測效果不一，經光譜預處理后，模型的準確率均有提高。其中經1SGD+MSC光譜預處理后，模型校正集和預測集的準確率均為100%。該模型可以區分開大鯢純肉樣和摻偽樣。

表2 不同光譜預處理方法所建摻偽大鯢肉粉PLS-DA（4分類）模型判別結果Table 2 Discrimination of three adulterated samples and authentic sample by PLS-DA models with different spectral pretreatments

由表2可以看出，各類判別模型的主因子數均為5，但模型校正集和預測集的準確率不同。其中1SGD+MSC光譜預處理效果最優，校正集和測試集的準確率高達100%。其他預處理方法均有誤判數，但準確率也在原始光譜之上。該模型可以區分開大鯢純肉樣、大鯢摻江團魚肉樣、大鯢摻草魚肉樣和大鯢摻土豆淀粉樣。

這可能是由于一階導數可對樣品差異導致的基線漂移具有消除作用，多元散射校正可消除樣品顆粒度和顆粒大小不均勻造成的散射影響，因此譜帶特征有所強化，譜帶重疊現象有所改善[24,32]。成芳等[33]比較了不同光譜預處理方法（MSC、SNV、一階導數及不同點數平滑）對不同部位豬肉糜所建的PLS-DA模型的影響，發現一階導數光譜預處理方法可使模型校正集和預測集的準確度分別達到100%和96%。Kamruzzaman等[34]比較了MSC、SNV、一階導數和二階導數等光譜預處理方法對牛肉摻馬肉定量模型的影響，發現相較于處理過的光譜，原始光譜的效果更好。徐文杰等[35]為建立最優的淡水魚魚種鑒別模型，采用MSC、標準化、正交信號校正、去趨勢校正、SNV、平滑、導數、基線校正等20 種光譜預處理方法，發現經過標準化處理后，模型效果最優。由此可見，最優光譜預處理方法的選擇和確定隨分析檢測對象的不同而存在差異。故本實驗確定1SGD+MSC為最優光譜預處理方法。

2.3 定量分析結果

建立PLS定量模型時，主因子數目會顯著影響PLS定量分析模型的預測結果。主因子數目過多，模型會出現過擬合現象；主因子數過少，模型的預測能力弱[36]。本實驗采取10-折交互驗證法，根據校正集RMSECV的變化值判斷主因子數對PLS定量分析模型的影響，獲得定量分析的最適主因子數。

圖4 江團魚肉粉摻偽定量分析結果Fig. 4 Quantitative model of adulteration of longsnout catfish meat powder

由圖4A可見，大鯢摻江團魚肉粉定量分析的最適主因子數為6。圖4B中大鯢摻江團魚肉粉定量模型的RMSEC和RMSEP分別為1.14%和0.83%，為0.990 6，為0.994 4。

圖5 草魚肉粉摻偽定量分析結果Fig. 5 Quantitative model of adulteration of grass carp meat powder

由圖5A可見，大鯢摻草魚肉粉定量分析的最適主因子數為11。圖5B中大鯢粉摻草魚肉粉定量模型的RMSEC和RMSEP分別為1.39%和0.89%，R2c為0.986 4，Rp2為0.992 4。

圖6 土豆淀粉摻偽定量分析結果Fig. 6 Quantitative model of adulteration of potato starch

由圖6可見，大鯢摻土豆淀粉定量分析的最適主因子數為10。圖6B中大鯢粉摻土豆淀粉定量模型的RMSEC和RMSEP分別為0.88%和1.22%，Rc2為0.993 3，Rp2為0.990 8。

3 結 論

運用近紅外光譜技術結合PLS-DA建立摻偽大鯢肉粉的定性鑒別方法。PLS-DA模型中，比較大鯢肉粉及其摻偽物的原始光譜以及經MSC、SNV、1SGD、1SGD+MSC和1SGD+SVN等光譜預處理后所建模型判別效果。確定1SGD+MSC為最佳光譜預處理方法，所建2分類和4分類模型校正集與預測集的準確率均為100%。

運用近紅外光譜技術結合PLSR建立摻偽大鯢肉粉定量校正模型，大鯢肉粉摻江團魚肉粉、大鯢肉粉摻草魚肉粉、大鯢肉粉摻土豆淀粉模型RMSEC分別為1.14%、1.39%、0.88%，為0.990 6、0.986 4、0.993 3；RMSEP分別為0.83%、0.89%、1.22%，為0.994 4、0.992 4和0.990 8，所建PLSR定量模型有很好的預測性能。近紅外光譜技術結合化學計量學方法能夠對大鯢肉粉進行摻偽鑒別和純度檢測。