超高效液相色譜-串聯質譜法測定豆芽中植物生長調節劑殘留量的不確定度評定

李 靜，張居舟*，余曉娟，劉 毅

（安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051）

豆芽因其烹飪方式不拘一格、營養豐富，且生產不受節令變化、區域限制而成為老百姓喜愛的家常菜。然而，一些不法商販為牟取高額利潤，在豆芽生產過程中濫用人工合成化學植物生長調節劑，企圖縮短豆芽生長周期，提高發芽率，增加芽菜顏值等，以致“毒豆芽”“問題豆芽”事件層出不窮[1-9]。添加的植物生長調節劑主要為多效唑、吲哚乙酸和吲哚丁酸等，長期食用會影響人體內分泌和代謝平衡等[9-11]。為確保食用安全，我國已明令禁止赤霉素等植物生長調節劑不再作為食品加工助劑，而多效唑等植物生長調節劑則被列為農藥范疇，嚴格控制其殘留量[12-13]。由于植物生長調節劑品種繁多，化學性質和生物特性各異，殘留水平較低，基質干擾較為嚴重，為確保檢測結果的準確性，須進行測量不確定度的評定。目前僅有6-芐基腺嘌呤的非標準方法的不確定度報道[14]，而多效唑等指定方法標準的不確定度研究尚處于空白。

測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結果相聯系的參數，其數值的大小反映了測量結果質量的高低，并直接與檢驗結果的合格判定相關[15-21]。本實驗參照JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》[22]和JJF 1135—2005《化學分析測量不確定度評定》[23]，通過BJS 201703《豆芽中植物生長調節劑的測定》[24]評定豆芽中多效唑、吲哚乙酸和吲哚丁酸3 種植物生長調節劑殘留量檢測的不確定度，以期為實驗室質量控制提供科學、準確、可信的依據，同時為測量其他植物生長調節劑殘留量的不確定度評定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

豆芽 市購。

吲哚乙酸標準溶液（100 μg/mL）、吲哚丁酸標準溶液（100 μg/mL）、多效唑標準溶液（100 μg/mL）上海市農藥研究所。

1290-6495型超高效液相色譜-串聯質譜儀 美國Agilent公司；移液器 美國Gilson公司；XS4002S型電子天平 瑞士梅特勒公司。

其余試劑、材料和設備參見BJS 201703的要求。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

按照BJS 201703的要求提取后，取上層乙腈溶液5 mL置于QuEChERS離心管（含300 mg無水硫酸鎂和100 mg C18）中，渦旋2 min，以14 000 r/min離心5 min，精密移取4 mL上清液于離心管中，于45 ℃水浴中氮吹至近干，用甲醇定容至1 mL，渦旋混勻，離心5 min，0.22 μm有機相濾膜過濾后，供UPLC-MS/MS測定。

1.2.2 超高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；進樣量：5 μL；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～1 min，維持10% B；1～3 min，10% B線性變至60% B；3～5 min，60% B線性變至90% B；5～7 min，維持90% B；7～7.1 min，線性變至10% B。

1.2.3 質譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子模式掃描；多反應監測；毛細管電壓3 000 V；干燥氣溫度230 ℃；干燥氣流速18 L/min；鞘氣溫度320 ℃；鞘氣流速12 L/min；噴嘴電壓500 V；霧化氣壓力30 psi。主要質譜參數見表1。

表1 種植物生長調節劑的主要質譜參數Table 1 Main mass spectrometric parameters for three plant growth regulators

1.2.4 數學模型的建立

按照BJS 201703的測定方法及結果計算，待測物的含量按（1）式計算：

式中：X為試樣中待測組分的含量/（μg/kg）；C為從標準工作曲線中讀出的試樣溶液中待測組分的質量濃度/（μg/L）；V為試樣溶液最終定容體積/mL；f為試樣制備過程中的稀釋倍數，本方法中為5；m為稱樣量/g。

標準工作曲線由最小二乘法進行線性擬合而成，外標法定量，并根據標準工作曲線以峰面積計算得到待測組分的質量濃度。標準溶液配制、體積量取等影響不確定度的相關因素之間采取多元回歸分析，確定多個變量的因果關系，建立預測的數學模型。

2 結果與分析

2.1 不確定度的來源分析

圖1 3 種植物生長調節劑的不確定度來源Fig. 1 Uncertainty sources for determination of three plant growth regulators

根據本實驗的測定過程，對豆芽中植物生長調節劑殘留量的測定結果有影響的各種不確定度的分量進行分析，具體引入的不確定度來源如圖1所示。

2.2 不確定度的評定

2.2.1 試樣稱量產生的不確定度u（m）

使用去皮稱量，稱取10.00 g豆芽樣品，天平校準證書說明最大允許誤差為±0.01 g，假設按矩形分布[15]，其不確定度u（m）=0.01/ =0.0058 g；urel（m）=u（m）/m=0.000 58。

2.2.2 體積量取產生的不確定度u（V）

2.2.2.1 提取液總體積引入的不確定度u（V1）

用20 mL單標吸量管移取V1為20 mL 1%甲酸的乙腈提取液，按A類評定，其體積允差為±0.03mL，假設按矩形分布，其不確定度u（V1-1）=0.03/ =0.017 32mL；若溫度允差為±5 ℃，則溫度變化引起的不確定度u（V1-2）=。故u=0.0 8 0 9 m L，urel（V1）=u（V1）/V1=0.004 0。

2.2.2.2 濃縮體積引入的不確定度u（V2）

用5 mL分度吸量管移取V2為4 mL 1%甲酸的乙腈凈化液進行濃縮，按A類評定，其體積允差為±0.025 mL，假設按矩形分布，其不確定度u（V2-1）=0.025/ =0.014 43 mL；若溫度允差為±5 ℃，則溫度變化引起的不確定度u（V2-2）=4×5×0.015 82mL。故u（V2）0.015 8 mL，urel（V2）=u（V2）/V2=0.004 0。

2.2.2.3 最終定容體積引入的不確定度u（V3）

試樣凈化液經氮吹濃縮后，用1 mL單刻度吸量管移取V3為1 mL甲醇溶解殘渣，按A類評定，其體積允差為±0.007 mL，假設按矩形分布，其不確定度u（V3-1）==0.004 04 mL；若溫度允差為±5 ℃，則溫度變化引起的不確定度u（V3-2）==1×5×1.1×故=0.005 1 mL，urel（V3）=u（V3）/V3=0.005 1。

2.2.3 待測物引入的不確定度

待測物（C）的不確定度來源由兩個因素組成，即標準系列溶液配制和由標準曲線擬合時所產生的不確定度。其中標準系列溶液配制包括儲備液配制、稀釋及標準曲線溶液配制3 個部分[25-28]。

2.2.3.1 儲備液配制過程引入的不確定度u（C1）

由標準證書可知，吲哚乙酸、吲哚丁酸及多效唑標準溶液相對不確定度均為urel（C1）=0.040 0。

2.2.3.2 儲備液稀釋過程引入的不確定度u（C2）

分別用1 mL單標線吸量管移取1 mL吲哚乙酸和吲哚丁酸儲備液、用0.2 mL分度吸量管移取0.2 mL多效唑儲備液于100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，得到吲哚乙酸和吲哚丁酸為1 μg/mL、多效唑為0.2 μg/mL質量濃度的混合標準溶液。按照矩形分布處理，參考GB/T 12806—2011《實驗室玻璃儀器 單標線容量瓶》[29]和JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規程》的要求[30]，按A類評定，玻璃器皿及溫度波動引入的不確定度見表2；則儲備液稀釋過程引入的相對標準不確定度吲哚乙酸和吲哚丁酸按urel計算，多效唑按

表2 儲備液稀釋過程中引入的不確定度Table 2 Uncertainty resulting from dilution of stock solution

2.2.3.3 標準系列溶液配制過程產生的不確定度u（C3）

表3 標準系列溶液配制過程引入的不確定度Table 3 Uncertainty resulting from preparation of standard solution

使用20、100、200 μL移液器分別移取10、20、50、100、200 μL混合標準溶液于1 mL容量瓶中，用空白豆芽基質溶液定容至刻度，得到質量濃度分別為10、20、50、100、200 μg/L的標準系列工作溶液，其中多效唑的質量濃度為2、4、10、20、40 μg/L。移液器的刻度誤差參考JJG 646—2006《移液器檢定規程》的要求[31]，按A類評定，如表3所示。則標準系列溶液配制過程引入的相對標準不確定度為

2.2.3.4 標準曲線擬合產生的不確定度u（C4）

將空白豆芽基質溶液配制的5 種不同質量濃度的標準系列溶液，各取5 μL分別重復進樣3 次，以峰面積（Ai）為縱坐標，標準溶液濃度（Ci）為橫坐標，采用最小二乘法擬合而成的線性回歸方程為Ai＝aCi+b，測定數據及計算結果如表4。取一陽性樣品，對各待測化合物濃度C0進行3 次重復測定，其結果見表5，則由標準曲線擬合產生的不確定度按（2）式計算：

式中：SR為標準溶液待測物峰面積殘差的標準差；a為斜率；b為截距；p為對樣品溶液C0的測定次數，p＝3；n為標準溶液測試次數，本實驗中5 個質量濃度重復測定3 次，n＝5×3＝15；Ai為標準溶液各點的待測物的峰面積；Ci為標準溶液各點的待測物的質量濃度；C0為校準方程求得的陽性樣品溶液中待測物的質量濃度；

為標準溶液的平均質量濃度，則相對標準不確定度urel（C4）＝u（C4）/C0，結果見表6。

表4 標準曲線數據Table 4 Results of standard curves

表5 陽性樣品測定結果Table 5 Results of determination of positive samples

表6 曲線擬合引入的不確定度相關量Table 6 Calculation of uncertainty resulting from curve fitting

2.2.4 重復性產生的不確定度u（X）

在空白豆芽試樣中添加水平為7.5 μg/kg多效唑和25 μg/kg吲哚乙酸及吲哚丁酸的標準溶液，平行測定10 次。將重復測定的含量平均值X、標準偏差S（X）結果分別代入公式u（X）＝u（X）/X）＝S（X）/ 和urel（X，由重復性引入的不確定度和相對不確定度結果如表7所示。

表7 豆芽中吲哚乙酸、吲哚丁酸和多效唑的測定結果Table 7 Results of determination of indole-3-acetic acid,3-indolebutyric acid and hydrochloride in bean sprouts

2.2.5 回收率產生的不確定度u（R）

測量回收率結果列于表7，按A類評定，將平均回收率、標準偏差S（R）的結果分別代入公式u（R）＝（R）＝u（R）/R，則得到回收率引入的不確定度和相對不確定度。

2.3 合成不確定度

3 種植物生長調節劑的相對不確定度分量見表8，若不考慮各不確定度的相關性，則其合成不確定度按公式計算。

表8 3 種植物生長調節劑相對不確定度分量Table 8 List of relative uncertainty components for three plant growth regulators

2.4 擴展不確定度及結果表示

依據CNAS-GL006：2018《化學分析中不確定度的評估指南》[15]，在95%置信區間，對于大多數測量選擇包含因子k＝2，則擴展不確定度由此得到豆芽中3 種植物生長調節劑含量的結果，詳見表9。

表9 3 種植物生長調節劑不確定度評定結果Table 9 Uncertainty evaluation for the determination of three plant growth regulators

3 結 論

從豆芽中3 種植物生長調節劑的測量不確定度評定過程可知，實驗的前處理、質譜測定、數據處理等過程均會引入不確定度。本研究系統深入地對標準溶液配制、標準溶液稀釋、實驗環境溫度、玻璃器皿、重復性、回收率、樣品稱量、體積量取等因素進行綜合考量，結果表明，標準溶液配制和標準曲線擬合過程引入的不確定度最大，其次是重復性、回收率和體積量取，而樣品稱量引入的不確定度可忽略不計。因此，在實驗操作過程中，可采取增加標準曲線溶液和平行樣品的測定次數，保持超高效液相色譜-質譜聯用儀良好的穩定性和較高的靈敏度，對標準溶液定期開展期間核查，對儀器進行校準或檢定，提升實驗員的操作水準等途徑，以減小測量的不確定度，從而確保檢測結果的準確性和可信度。