嬰幼兒配方奶粉中氯丙醇脂肪酸酯的檢測方法優(yōu)化與污染暴露

張 妮，周 靜*，胡守江，葉 青，彭亞鋒，陸 壹

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海 200233）

氯丙醇脂肪酸酯（氯丙醇酯）在生物體內(nèi)經(jīng)脂肪酶水解成氯丙醇[1-2]，而氯丙醇中研究最多的是3-氯-1,2-丙二醇（3-monochloropropane-1,2-diol，3-MCPD），3-MCPD具有神經(jīng)、腎臟、遺傳毒性以及潛在的致突變性[3-5]，是國際公認的食品污染物。氯丙醇多以酯的形式存在于精煉植物油和富含油脂食品中，且酯的含量遠高于其游離態(tài)的氯丙醇[6-7]。由于棕櫚油、菜籽油等精煉植物油在嬰幼兒配方奶粉中的廣泛使用，導(dǎo)致嬰幼兒配方奶粉中也存在一定程度的氯丙醇酯污染[8-10]，但因缺乏足夠的科學(xué)數(shù)據(jù)和膳食數(shù)據(jù)支持，目前我國尚未制定嬰幼兒配方奶粉以及其他食品中氯丙醇酯的限量。

食品中氯丙醇酯的檢測目前主要有直接測定法與間接測定法：直接測定法采用液相色譜-質(zhì)譜法對具體的氯丙醇酯單體分別定量，不需衍生，前處理較為簡單[11-13]，但因氯丙醇酯種類較多且標準品不易獲得影響總量的計算；間接測定法采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)通過酯交換反應(yīng)將氯丙醇酯水解為氯丙醇，以氯丙醇的含量表征氯丙醇酯的含量[14-16]，該方法可測定氯丙醇酯的總量，能準確反映食品中氯丙醇酯的真實污染狀況，更加適合膳食暴露研究。

國外對各類食品包括植物油、咖啡、糕點、餅干、嬰幼兒食品中3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯（3-monochloropropane-1,2-diol ester，3-MCPDE）的研究較多，國內(nèi)主要集中于研究植物油中的3-MCPDE和2-氯-l,3-丙二醇脂肪酸酯（2-monochloropropane-1,3-diol ester，2-MCPDE），國內(nèi)外同時檢測嬰幼兒配方奶粉中4 種氯丙醇酯并對其總量進行風(fēng)險評估的文獻較少[9-10,17]，且忽略了嬰幼兒配方奶粉同時存在縮水甘油酯[18-19]的可能情況，而縮水甘油酯在一定條件下能轉(zhuǎn)化成氯丙醇酯，若前處理條件控制不當，會造成氯丙醇酯的含量測定值偏高。本研究在GB 5009.191—2016《食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的測定》基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化完善，并結(jié)合考慮如何防止樣品中可能存在的縮水甘油酯轉(zhuǎn)化成氯丙醇酯，通過對水解條件、pH值、萃取溶劑、衍生條件的系統(tǒng)性優(yōu)化，利用GC-MS可靠的定性能力，再結(jié)合穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)，大大提高了檢測方法的準確度和精密度，并對50 份上海市售嬰幼兒配方奶粉的氯丙醇酯污染水平進行調(diào)查分析和風(fēng)險暴露評估，為生產(chǎn)企業(yè)進行產(chǎn)品的安全控制和政府部門制定嬰幼兒配方奶粉中氯丙醇酯的限量提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

共50 份嬰幼兒配方奶粉樣品（國產(chǎn)奶粉33 份，進口奶粉17 份），購于商超、母嬰店和各大電商平臺，其中0～6 月齡奶粉15 份、6～12 月齡奶粉18 份、12～36 月齡奶粉17 份?？瞻谆|(zhì)特級初榨橄欖油和脫脂奶粉購于大型商超。

標準品：3-MCPD棕櫚酸二酯（純度＞96.5%）日本和光（Wako）純藥工業(yè)株式會社；2-MCPD硬脂酸二酯（純度＞98.0%）、D5-2-MCPD硬脂酸二酯（純度＞98.0%）、D5-2,3-二氯-1-丙醇（2,3-dichloropropane-1-ol，D5-2,3-DCP）（純度＞98.0%） 加拿大TRC公司；1,3-DCP（純度＞99.0%）、2,3-DCP（純度＞98.6%）德國Dr Ehrenstorfer公司；D5-3-MCPD棕櫚酸二酯（純度＞98.5%）、D5-1,3-DCP（純度＞98.9%） 加拿大C/D/N ISOTopes公司。由于市場上暫無1,3-DCPE、2,3-DCPE及其相應(yīng)內(nèi)標售賣，因此加標實驗用l,3-DCP、2,3-DCP代替1,3-DCPE、2,3-DCPE，內(nèi)標用D5-1,3-DCP、D5-2,3-DCP代替D5-1,3-DCPE、D5-2,3-DCPE。

甲醇鈉（含量＞96%） 日本TCI公司；七氟丁酰基咪唑（heptafluoro-butyryl imidazole，HFBI，含量＞97.5%） 德國Sigma公司；無水乙醚、石油醚、甲醇、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、正己烷、異辛烷（均為色譜純）美國Fisher公司；無水乙醇、無水硫酸鈉、氯化鈉、濃硫酸（均為分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；EXtrelut NT硅藻土固相萃取柱 德國Merck公司；無水硫酸鎂-無水乙酸鈉（4∶1，m/m） 沃特世科技（上海）有限公司。

標準溶液的配制：稱取各標準品適量（精確至0.01 mg）于50 mL棕色容量瓶中，用正己烷定容至刻度，分別配制成200 mg/L（均以相應(yīng)的氯丙醇計）的單一標準儲備液，于－20 ℃保存。將標準儲備液用正己烷稀釋并定容，分別配制成2.0 mg/L（均以相應(yīng)的氯丙醇計）的氯丙醇酯混合標準工作液和氘代氯丙醇酯混合標準工作液。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；MS104S電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；渦旋混合器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；SK8210LHC超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；DL-5C低速大容量離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肪提取

稱取奶粉4 g（精確至0.000 1 g）于抽脂瓶中，加入10 mL 65 ℃去離子水溶解，后加入2 mL氨水，渦旋混勻后放置于65 ℃水浴中15～20 min。取出冷卻后，依次加入10 mL無水乙醇、25 mL乙醚和25 mL石油醚，充分振蕩1 min。靜置后取上層液于250 mL脂肪收集瓶中；抽脂瓶中再加入15 mL乙醚和15 mL石油醚重復(fù)提取2 次，將脂肪收集瓶放在水浴鍋上蒸干溶劑，置于（100±2）℃烘箱干燥1 h，冷卻后稱質(zhì)量（精確至0.000 1 g），通過與空管的質(zhì)量差值計算試樣的脂肪含量。提取的脂肪置于4 ℃保存，供后續(xù)氯丙醇酯含量測定用。

1.3.2 樣品水解、凈化、衍生

稱取上述提取的脂肪0.1 g（精確至0.000 1 g）于15 mL塑料離心管內(nèi)，加入500 μL叔丁基甲基醚-乙酸乙酯（8∶2，V/V），后準確加入100 μL 2.0 mg/L氘代氯丙醇酯混合標準工作液，超聲20 min。加入1.0 mL 0.1 mol/L甲醇鈉甲醇溶液，渦旋并計時5 min后，加入75 μL中和劑（濃硫酸-飽和硫酸鈉溶液（1∶40，V/V）），充分渦旋。加入3 mL正己烷去除油脂等雜質(zhì)，水相層全部轉(zhuǎn)入EXtrelut NT硅藻土固相萃取柱中，平衡靜置10 min。加入20 mL乙酸乙酯洗脫，洗脫液濃縮近干，無水硫酸鈉脫水，用2 mL異辛烷復(fù)溶。迅速加入50 μLHFBI，渦旋后室溫放置30 min。加飽和氯化鈉溶液2 mL，終止反應(yīng)，取上清液進樣。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）石英毛細管柱；不分流進樣；進樣體積：1.0 μL；進樣口溫度：280 ℃；載氣：高純氦氣，恒流，流速1.0 mL/min；程序升溫：40 ℃保持1 min，然后以2 ℃/min程序升溫至80 ℃，再以30 ℃/min升溫至300 ℃，保持2 min。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電子電離源；電離能量：70 eV；監(jiān)測方式：選擇離子監(jiān)測模式；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度280 ℃；溶劑延遲6 min。主要方法學(xué)參數(shù)見表1。

1.3.4 樣品中指標測定

1.3.4.1 氯丙醇酯的含量

樣品中氯丙醇酯含量計算公式如下：

式中：X為奶粉中氯丙醇酯（以氯丙醇計）含量/（mg/kg）；c為由線性方程計算得到的試樣溶液中氯丙醇酯（以氯丙醇計）的質(zhì)量/ng；c0為試樣空白溶液中氯丙醇酯（以氯丙醇計）的質(zhì)量/ng；f為稀釋倍數(shù)；m為脂肪的取樣量/g；F為奶粉中脂肪的質(zhì)量分數(shù)/%；1 000和100為換算系數(shù)。

1.3.4.2 氯丙醇酯的暴露量

氯丙醇酯暴露量計算公式如下：

式中：I為氯丙醇酯（以氯丙醇計）的暴露量/（μg/kg）；X為奶粉中氯丙醇酯（以氯丙醇計）的含量/（mg/kg）；S為每日奶粉攝入量/g；M為嬰幼兒體質(zhì)量/kg。

嬰幼兒在不同月齡體質(zhì)量與奶粉攝入量見表2。

表2 不同月齡嬰幼兒體質(zhì)量和嬰幼兒配方奶粉日攝入量Table 2 Body mass and daily intake of formula milk powder for infants of different ages

1.4 數(shù)據(jù)和圖像處理方法

用Excel 2013計算平行數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿水解條件的優(yōu)化

間接測定氯丙醇酯多采用甲醇鈉-甲醇溶液[20-21]或硫酸甲醇[16,22]溶液進行酯交換反應(yīng)。根據(jù)文獻報道[23]，3-MCPD的前體物質(zhì)如縮水甘油酯在含有氯離子的酸性溶液環(huán)境中容易轉(zhuǎn)化成3-MCPD，造成檢測結(jié)果偏高。故本實驗選用甲醇鈉-甲醇溶液進行堿水解條件的優(yōu)化。通過比較標準物質(zhì)（3-MCPD棕櫚酸二酯）水解之后生成棕櫚酸甲酯的量以考察水解效率。分別比較0.1、0.2、0.5 mol/L甲醇鈉-甲醇溶液在水解時間1、2、3、4、5 min棕櫚酸甲酯的響應(yīng)值，選擇最佳水解條件，結(jié)果見圖1。

圖1 水解條件對棕櫚酸甲酯響應(yīng)的影響（n=3）Fig. 1 Effect of different hydrolysis conditions on response of methyl palmitate (n = 3)

由圖1可知，0.1 mol/L和0.2 mol/L甲醇鈉-甲醇水解時，棕櫚酸甲酯的峰面積均隨水解時間的延長而增加，尤其0.1 mol/L條件下，隨著時間的延長增幅明顯，在4 min時較1 min響應(yīng)值提高1 倍。而0.5 mol/L條件下，水解時間2 min時響應(yīng)值達到高點，之后隨著時間延長響應(yīng)值有所降低。

有研究認為酯交換反應(yīng)時間應(yīng)控制在1 min[20]或4 min[24-25]左右，因酯交換反應(yīng)時間延長會引起氯丙醇的降解。故本研究從上述條件下選出響應(yīng)值較高的5 個點，即0.1 mol/L條件下水解5 min，0.2 mol/L條件下水解3、4、5 min，0.5 mol/L條件下水解2 min，比較氯丙醇酯含量的高低，結(jié)果見圖2。

圖2結(jié)論與圖1基本一致：0.1 mol/L水解5 min時含量最高，0.2 mol/L水解5 min和0.5 mol/L水解2 min時含量次之。當配制濃度為0.5 mol/L甲醇鈉-甲醇的溶液時，容器底部有沉淀析出，不能形成均勻穩(wěn)定的溶解液，從而引起實驗結(jié)果偏差，且堿性較強，對水解時間要求較嚴，需嚴格控制在2 min之內(nèi)。綜上考慮，本研究選用甲醇鈉濃度為0.1 mol/L，水解時間為5 min，既保證了水解效率最高又適合大批量樣品的同時處理。

圖2 水解條件對氯丙醇酯測定結(jié)果的影響（n=3）=3Fig. 2 Effect of different hydrolysis conditions on results of determination of MCPDEs (n = 3)

2.2 pH值對結(jié)果的影響

氯丙醇酯經(jīng)酯交換反應(yīng)水解為游離的氯丙醇，過量的甲醇鈉形成的強堿體系會使3-MCPD降解，2-MCPD可能有類似反應(yīng)[20]，需要立即加入中和劑進行中和。本研究比較酯交換反應(yīng)終止之后，控制pH值為1、2、3、4、5、6條件下氯丙醇酯的含量，結(jié)果見圖3。3-MCPDE受pH值的影響波動較大，其中，pH 4時3-MCPDE的回收率偏高（116%），2-MCPDE、1,3-DCPE和2,3-DCPE受pH值的影響相對較小。從回收率的穩(wěn)定性和奶粉中存在縮水甘油酯的可能性，應(yīng)避開酸性環(huán)境，控制pH值為5或6。

圖3 pH值對氯丙醇酯測定結(jié)果的影響（n=3）Fig. 3 Effect of pH on results of determination of MCPDEs (n = 3)

2.3 水解液萃取過程中萃取溶劑對結(jié)果的影響

考慮到配方奶粉所用的配料精煉食用油中可能含有縮水甘油酯[18-19]，故本實驗在空白奶粉基質(zhì)中同時添加已知量的氯丙醇酯和縮水甘油酯標準物質(zhì)，比較飽和Na2SO4、20% NaCl、飽和NaCl溶液3 種萃取劑對實驗結(jié)果的影響，見圖4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20% NaCl和飽和NaCl作為萃取劑的效果一致，均會增加3-MCPDE的含量，增幅為36%。佐證了氯離子存在時縮水甘油酯轉(zhuǎn)化成3-MCPD的結(jié)論[23]。為防止縮水甘油酯轉(zhuǎn)化成氯丙醇酯，造成氯丙醇酯的測定值偏高，本研究采用飽和Na2SO4溶液作為萃取劑。

圖4 萃取劑對氯丙醇酯測定結(jié)果的影響（n=3）Fig. 4 Effect of different extraction solvents on results of determination of MCPDEs (n = 3)

2.4 衍生條件的確定

可供選擇的衍生試劑有H F B I、苯基硼酸（p h e n y l b o r o n i c a c i d，P B A）、七氟丁酸酐（heptafluorobutyric anhydride，HFBA）、三氟乙酸酐（trif l uoroacetic anhydride，TFAA）等。PBA反應(yīng)可在水溶液中進行，但只能特異性地和二醇類反應(yīng)，不能衍生1,3-DCP和2,3-DCP[26]；HFBA和TFAA的衍生反應(yīng)容易進行，但產(chǎn)生的有機酸副產(chǎn)物可能會分解氯丙醇衍生物，且靈敏度不高[26]。相比之下，HFBI衍生后的化合物電負性增強顯著，檢測靈敏度較高，且化合物比較穩(wěn)定[27]。缺點是HFBI易與水反應(yīng)，衍生之前需注意除水，衍生過程中需注意防水。

比較無水硫酸鈉和商品化脫水劑（無水硫酸鎂-無水乙酸鈉（4∶1，m/m））對目標化合物測定結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)使用無水硫酸鈉對目標化合物的損失較小，且綜合考慮試劑成本，最終選用無水硫酸鈉作為脫水劑。需要注意的是無水硫酸鈉必須經(jīng)過灼燒處理以消除試劑水分，否則會影響后續(xù)衍生。

比較正己烷和異辛烷作為衍生復(fù)溶溶劑對氯丙醇酯測定結(jié)果的影響，見圖5。異辛烷的效果好于正己烷，主要體現(xiàn)在對2-MCPDE和2,3-DCPE的影響上，因此選用異辛烷進行復(fù)溶。

圖5 衍生復(fù)溶溶劑對氯丙醇酯測定結(jié)果的影響（n=3）Fig. 5 Effect of derivative solvents on results of determination of MCPDEs (n = 3)

2.5 空白加標回收實驗結(jié)果

在空白奶粉基質(zhì)中添加3-MCPD棕櫚酸二酯、2-MCPD硬脂酸二酯、1,3-DCP和2,3-DCP的標準溶液，使含量分別為0.03、0.075 mg/kg和0.15 mg/kg三個水平（以氯丙醇計），按已優(yōu)化的方法測定，回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）結(jié)果見表3。

表3 空白奶粉基質(zhì)加標回收實驗結(jié)果（n=6）Table 3 Spiked recoveries of blank milk powder (n =66))

由表3可知，空白奶粉基質(zhì)在0.03、0.075 mg/kg和0.15 mg/kg水平下的加標回收率在82.2%～113.9%之間，RSD均不大于8.3%。方法的準確度和精密度良好，符合分析的要求。

質(zhì)量濃度為0.1 mg/L的氯丙醇酯標準品衍生物的總離子流圖見圖6。加標量為0.15 mg/kg的樣品總離子流圖見圖7。

圖6 0.1 mg/L氯丙醇酯標準品衍生物的總離子流圖Fig. 6 Total ion current chromatograms of CPFAE derivatives at 0.1 mg/L

圖7 加標量為0.15 mg/kg的樣品總離子流圖Fig. 7 TIC chromatogram of sample spiked at 0.15 mg/kg

2.6 實際樣品的測定結(jié)果

由表4可見，在所調(diào)查的50 份嬰幼兒配方奶粉中，3-MCPDE的檢出率最高（100.0%），含量也最高，為0.037～0.208 mg/kg，其中0～6、6～12、12～36 月齡的含量分別為0.073～0.208、0.046～0.179、0.037～0.189 mg/kg；其次是2-MCPDE，檢出率為42.0%，含量在ND～0.060 mg/kg之間，其中0～6、6～12、12～36 月齡的含量分別為ND～0.060、ND～0.054、ND～0.047 mg/kg；1,3-DCPE和2,3-DCPE均未檢出。污染水平與李珊等[17]的研究基本一致。

表4 50 份嬰幼兒配方奶粉中氯丙醇酯含量測定結(jié)果（ =3）Table 4 Results of determination of CPFAE contents in 50 samples ( = 3)

國內(nèi)外的嬰幼兒配方奶粉，大多是將葵花籽油、玉米油、棕櫚油、大豆油等各種精煉植物油復(fù)合加入脫脂乳粉中，以從脂肪酸種類方面來模仿母乳。作為含約20%比例脂肪的嬰幼兒配方奶粉，其氯丙醇酯的污染主要來源于其精煉植物油配料。不同月齡的配方奶粉氯丙醇酯的含量與其脂肪含量存在一定的相關(guān)性。由表4可知，0～6 月齡的脂肪含量大于6～12、12～36 月齡，導(dǎo)致0～6 月齡奶粉中的氯丙醇酯含量最高。

由于目前國內(nèi)外均未制定氯丙醇酯的安全攝入量，本實驗按照德國聯(lián)邦風(fēng)險評估機構(gòu)[28]和歐盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）[29]的一致做法，假定3-MCPDE和2-MCPDE在人體內(nèi)可100%轉(zhuǎn)化為3-MCPD和2-MCPD，按3-MCPD的每日耐受攝入量（tolerable daily intake，TDI）進行評估。針對嬰幼兒這一特殊敏感群體，氯丙醇酯的暴露風(fēng)險按EFSA 2016年最新制定的3-MCPD的TDI為0.8 μg/kg進行評估。由表4可知，嬰幼兒配方奶粉中氯丙醇酯對不同月齡嬰幼兒的平均暴露量分別為：0～6 月齡3.86 μg/kg、6～12 月齡2.00 μg/kg、12～36 月齡1.07 μg/kg。其中，0～6 月齡嬰幼兒氯丙醇酯的平均暴露水平最高，是TDI的4.8 倍，100%（15/15）超過限值，P95為4.87 μg/kg。這主要是由于一階段奶粉脂肪含量較高，而新生兒體質(zhì)量較低，且奶粉的每日攝入量高；6～12 月齡嬰幼兒氯丙醇酯的平均暴露水平是TDI的2.5 倍，94.4%（17/18）超過限值，P95為3.31 μg/kg；12～36 月齡嬰幼兒奶粉攝入量少，體質(zhì)量較大，所以平均暴露水平相對0～6、6～12 月齡較低，是TDI的1.3 倍，但76.5%（13/17）超過限值，P95為1.77 μg/kg。且12～36 月齡嬰幼兒對其他富含油脂的食物攝入比重加大，對氯丙醇酯的攝入風(fēng)險仍不容小覷。本實驗是假定目標物在體內(nèi)的消化吸收率為100%，所以可能存在一定的高估其風(fēng)險。

3 結(jié) 論

對同時測定嬰幼兒配方奶粉中氯丙醇酯含量的GC-MS分析方法進行優(yōu)化，對方法的線性范圍、檢出限、定量限和準確度等技術(shù)參數(shù)進行評價，并用此法檢測市售50 份嬰幼兒配方奶粉中氯丙醇酯的含量。結(jié)果顯示，3-MCPDE的檢出率最高，含量也最高；其次是2-MCPDE；1,3-DCPE和2,3-DCPE均未檢出。統(tǒng)計嬰幼兒配方奶粉的平均暴露量，0～6 月齡3.86 μg/kg、6～12 月齡2.00 μg/kg、12～36 月齡1.07 μg/kg，分別為TDI的4.8、2.5、1.3 倍。對于將配方奶粉作為主要營養(yǎng)攝入來源的嬰幼兒來說，尤其是0～12 月齡的嬰兒，氯丙醇酯攝入的健康風(fēng)險需引起關(guān)注。解決氯丙醇酯問題的關(guān)鍵在于植物油配料。為了保護嬰幼兒的安全，生產(chǎn)廠家應(yīng)謹慎選擇原料，盡可能降低嬰幼兒配方奶粉中氯丙醇酯的污染。