分批補料高密度發酵生產丙酸桿菌素及其結構分析

鄭麗雪，王家皓，陳志鵬，齊 斌，王立梅*

（常熟理工學院 蘇州市食品生物技術重點實驗室，發酵工程技術研究中心，江蘇 常熟 215500）

隨著人們對食品安全問題的關注度日益增強，天然防腐劑的開發應用受到廣泛的重視。其中，微生物源防腐劑乳酸鏈球菌素（Nisin）早在1969年就被聯合國糧農組織/世界衛生組織批準為高效安全天然食品防腐劑，且目前有部分學者正在研究將Nisin應用于食品包裝中；ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）于2003年10月被美國食品藥品監督管理局批準為安全食品保鮮劑，美國、韓國和日本已經允許將ε-PL應用于食品保鮮防腐中；溶菌酶也已經廣泛應用于肉制品、水產品和乳制品等食品防腐中[1-4]。此外，乳桿菌細菌素、曲酸、納他霉素、羅伊氏菌素等微生物源防腐劑以及植物產生的次生代謝產物精油在食品工業以及化妝品行業中都有廣泛的應用[5-11]。

近年來，具有抑菌活性的丙酸桿菌代謝物（丙酸桿菌細菌素）也備受關注，細菌素可通過多種機制抑制有害菌的生長[12-13]。法國羅地亞公司已經開發得到一種含有丙酸桿菌細菌素的新型生物防腐劑，得到了美國食品藥品監督管理局的批準，產品已在美國和歐洲市場上銷售[14]。孫帥等[15]將70%～80%的特氏丙酸桿菌代謝物與20%～30%的Nisin混合制成了一種新型生物防腐保鮮劑，這種保鮮劑天然安全無毒，而且抑菌譜廣，將此保鮮劑應用于草莓的貯藏中，大大降低了草莓的呼吸強度，減緩了草莓的質量損失率，降低了草莓的腐爛率。目前，國內大量研究還是圍繞高產丙酸桿菌素菌株的制備[16]、培養基的優化[17]、代謝物的抑菌活性[18]以及丙酸桿菌素的分離純化[19]等方面，對于高密度發酵生產丙酸桿菌細菌素的研究較少，而高密度發酵是進行工業化生產的前提。

有學者發現單一碳源不利于丙酸桿菌的生長，丙酸桿菌的最適復合碳源為乳酸鈉、葡萄糖分別15、5 g/L，在此基礎上，研究還發現每隔24 h補加一次3 g/L的復合碳源，能最大程度地提高丙酸桿菌的抑菌活性[20-21]。目前高密度方面的研究都集中在丙酸桿菌生長所需的碳源上，對氮源的研究比較少。有研究報道玉米漿可以代替丙酸桿菌生長所需的最適氮源酵母粉，可以在一定程度上提高丙酸桿菌代謝物的抑菌活性[22]。據此，本研究嘗試將玉米酒糟清液作為丙酸桿菌發酵所需的氮源，因為酒糟清液與玉米漿在堿度及營養物質含量上基本相似[23]，兩者都含有蛋白質、脂肪、纖維素、礦物元素及少量的淀粉等營養物質，且玉米酒糟來源充足，運輸方便且物美價廉。另外，有報道細菌素是具有抗微生物活性的肽或蛋白質[24-25]，本研究也將探討實驗菌株所產丙酸桿菌素的性質，分析其是否也屬于蛋白類物質，為后續的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

菌種：Propionibacterium freudenreichii CS1420（保藏登記號CCTCC NO：M 2015050）、大腸桿菌（ATCC25922）均為常熟理工學院生物與食品工程學院發酵工程中心保存。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1B超凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；YXQLS-100A型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；CR22G II型高速冷凍離心機 日本日立公司；PE20型實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FA604A型精密電子天平 上海精天電子儀器有限公司；XMARK型微孔板、分光光度計美國Bio-Rad公司；UV-2450型紫外分光光度計 日本島津公司；NicoletIS10傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養

將P. freudenreichii CS1420單菌落接種至改良胨酵母浸膏葡萄糖（peptone yeast extract glucose，PYG）培養基[14]中活化，30 ℃厭氧培養2.5 d。

1.3.2 擴大培養

將種子液按照10%接種量接入裝有乳酸鈉（sodium lactate broth，SLB）培養基[14]的三角瓶中，30 ℃厭氧培養2.5 d。

1.3.3 分批發酵

將擴大培養好的種子液按10%接種量接種至裝有2 L SLB培養基的5 L發酵罐中，發酵溫度30 ℃，轉速100 r/min，發酵期間通入CO2使罐壓保持0.05 MPa，控制pH 6.0，發酵時間8 d。

1.3.4 分批補加復合碳源

分批補加的復合碳源為75%乳酸鈉和25%葡萄糖混合溶液。從高密度發酵的96 h開始，每隔24 h補加復合碳源和2 g/L的酵母粉，連續補充5 次，每次碳源、氮源分別補料100 mL，補料速率為10 mL/min，其余發酵條件參照1.3.3節。其中每次發酵時復合碳源補加量分別為2、2.5、3、3.5 g/L和4 g/L，進行5 次發酵確定最佳復合碳源添加量。

1.3.5 分批補加復合氮源

分批補加的復合氮源為2 g/L酵母溶液與玉米酒糟清液混合液。玉米酒糟清液是將酒糟與蒸餾水按照質量比1∶4配制，30 ℃攪拌3 h，5 000 r/min離心5 min，取上清液[26]。從高密度發酵96 h開始，每隔24 h補加2.5 g/L復合碳源和復合氮源，連續補充5 次，每次碳源、氮源分別補料100 mL，補料速率為10 mL/min，其余發酵條件參照1.3.3節。其中每次發酵時復合氮源補加量分別為酵母溶液與玉米酒糟清液體積比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50，進行5 次發酵確定最佳復合氮源添加量。

1.3.6 指示菌的制備

將活化好的大腸桿菌接種至LB液體培養基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養至菌液的OD600nm為0.2，然后用無菌LB培養基稀釋100倍備用。

1.3.7 丙酸桿菌素的制備

將發酵液在4 ℃、6 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，用2.5 mol/L NaOH溶液調至pH 7.0，再用10%酒石酸調至pH 5.5，然后將發酵液用截留分子質量為3 000 u的超濾膜進行超濾，去除較大分子物質，得到丙酸桿菌素粗提清液。

1.3.8 硫酸銨沉淀丙酸桿菌素的制備

將發酵液在4 ℃、8 000 r/min離心5 min，分別取離心上清液20 mL，邊攪拌邊緩慢向上清液中添加硫酸銨粉末（冰水浴），至硫酸銨終質量分數分別為30%、40%、50%、60%、70%，繼續攪拌均勻，放于4 ℃冰箱中沉淀過夜，在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，將離心后的沉淀物進行冷凍干燥。

1.3.9 抑菌活性的測定

參照文獻[27]并適當改進。將丙酸桿菌素粗提物用無菌的LB溶液進行2n梯度稀釋，然后將不同稀釋倍數的抑菌物質分別加入96 孔酶標板中，每孔總體積為200 μL，其中20 μL為不同稀釋倍數的抑菌物質，180 μL為指示菌菌液。用20 μL空白LB液體培養基和180 μL指示菌菌液作為對照，將酶標板置于30 ℃恒溫培養，每隔一定時間取出用酶標液測定各加樣孔在600 nm波長處OD值。當OD600nm為對照組一半時的稀釋度定義為一個抑菌活性單位，單位為AU/mL。

1.3.10 丙酸桿菌素的結構表征

1.3.10.1 紅外光譜分析

取一定量充分干燥后的丙酸桿菌素，將其與一定量的KBr混勻后壓片，在400～4 000 cm－1范圍內進行紅外光譜掃描[28]。

1.3.10.2 蛋白酶敏感實驗[29]

抑菌活性檢測：向牛津杯中加入250 μL溶液，將檢測平皿放置在37 ℃培養箱培養24 h后觀察抑菌效果。

蛋白酶敏感性檢測：用胰蛋白酶和中性蛋白酶對硫酸銨鹽析沉淀溶液進行酶解實驗，首先調節硫酸銨鹽析沉淀溶液的pH值至兩種酶的最適作用值（pH 7.0、pH 2.0），各取1 mL分別加入兩種酶，使酶終質量濃度為1 mg/mL，37 ℃水浴2 h，100 ℃加熱l min滅酶，之后將pH值回調，進行抑菌活性檢測，以未經酶處理的70%硫酸銨鹽析沉淀溶液作為對照。

1.4 數據統計及分析

實驗涉及數據處理均采用Excel 2016完成，所有作圖均采用Origin 8.5完成。

2 結果與分析

2.1 分批發酵對丙酸桿菌生長的影響

圖1 丙酸桿菌分批發酵規律曲線Fig. 1 Time courses of mycelial growth and antibacterial activity of propionin in fed-batch fermentation of P. freudenreichii

從圖1可以看出，從96 h開始，丙酸桿菌菌體干質量增加緩慢，這表明從96 h開始丙酸桿菌的生長受到限制，其抑菌活性基本保持不變，最高抑菌活性為17.6 AU/mL。丙酸桿菌素的發酵過程中，不斷分解利用還原糖，在進入發酵穩定期前大量消耗還原糖。在發酵進入穩定期后，丙酸桿菌素開始大量合成，由于其可能是蛋白質，而此時發酵液中還原糖和氨基氮含量已經很低，限制了其高效合成[20]。通過分批補加碳源和氮源的方式有助于丙酸桿菌在穩定期后高效合成丙酸桿菌素，提高丙酸桿菌素的產量。

2.2 分批補加復合碳源對丙酸桿菌素發酵規律的影響

圖2 分批補加復合碳源對丙酸桿菌素發酵規律的影響Fig. 2 Effect of supplementation of carbon sources on mycelial growth and antibacterial activity of propionin

從圖2可以看出，當混合碳源添加量在2.5 g/L時，丙酸桿菌相對生長較好，菌體干質量最高，在該條件下的丙酸桿菌素抑菌活性最高，可以達到30.5 AU/mL。丙酸桿菌能在葡萄糖、半乳糖、乳糖、阿拉伯糖等單一碳源培養基上生長[21]。而乳酸鹽是丙酸桿菌可高效利用的碳源，其中乳酸鈉是培養丙酸桿菌最常用的碳源[30]。而葡萄糖是工業生產中常用的碳源，研究表明丙酸桿菌在含有葡萄糖和乳酸鹽的組合培養基中能更好地利用乳酸鹽，從而提高丙酸桿菌素的產量[21]。因此該復合碳源最佳添加量為2.5 g/L。

2.3 分批補加復合氮源對丙酸桿菌素發酵規律的影響

圖3 分批補加復合氮源對丙酸桿菌素發酵規律的影響Fig. 3 Effect of supplementation of nitrogen sources on mycelial growth and antibacterial activity of propionin

從圖3可看出，當酵母溶液與玉米酒糟清液體積比為1∶30時，丙酸桿菌的生長旺盛，菌體干質量相對較高，同時在此條件下發酵得到的丙酸桿菌素的抑菌活性最高，可以達到31.2 AU/mL。2 g/L酵母溶液是丙酸桿菌發酵最佳補加氮源[20]，但酵母價格較高，工業化生產成本較大，而玉米和普通酒糟中都富含氨基酸，玉米酒糟中氨基酸含量很高，可以提供足夠的氨基氮，促進合成丙酸桿菌素，而且玉米酒糟價格低廉，可以大大降低工業化生產的成本，為工業化生產奠定良好的基礎。因此該復合氮源最佳比例為1∶30。

2.4 丙酸桿菌素的結構表征

2.4.1 紅外光譜分析[31-32]

圖4 丙酸桿菌素紅外光譜圖Fig. 4 Infrared spectrum of propionin

從圖4可見，肽鏈官能團—NH—CO—的特征吸收譜帶。1 558 cm－1附近的吸收表示N—H相對于C=O以反式構型的形式存在；1 408 cm－1附近的吸收是順式構型。這些吸收包含N—H彎曲振動和C—N伸縮振動的因素。1 638 cm－1的強吸收為肽鍵中的C=O雙鍵的伸縮振動。2 976 cm－1和2 900 cm－1處的峰為飽和烷烴的C—H伸縮振動峰。3 412 cm－1處的寬峰為酰胺鍵中的N—H伸縮振動產生。

2.4.2 丙酸桿菌素蛋白酶敏感實驗

表1 丙酸桿菌素蛋白酶解實驗結果Table 1 Proteolytic sensitivity of propionin

圖5 70 0%硫酸銨沉淀物抑菌效果與蛋白酶水解實驗Fig. 5 Antibacterial activity and proteolytic sensitivity of bacteriocin precipitated with 70% ammonium sulphate

對丙酸桿菌素溶液進行蛋白酶解檢測，結果如表1和圖5所示，70%硫酸銨鹽析沉淀溶液經胰蛋白酶和中性蛋白酶反應后，抑菌活性無。結合丙酸桿菌素的紅外圖譜以及其蛋白酶敏感實驗可以確定，P. freudenreichiiCS1420產丙酸桿菌素是具有抑菌活性的蛋白類物質。

3 結 論

以分批補加碳源氮源的高密度發酵方法提高丙酸桿菌的生長量及其丙酸桿菌素的抑菌活性。創新性地在其發酵過程中用玉米酒糟清液代替部分酵母溶液作為碳源，在一定程度上提升了丙酸桿菌素的抑菌活性。研究得出兩個結論：1）分批添加復合碳源和復合氮源后，分批發酵制得的丙酸桿菌素的抑菌活性從17.6 AU/mL提高到31.2 AU/mL；2）由P. freudenreichiiCS1420產生的丙酸桿菌素是具有抑菌活性的蛋白類物質。

來源于乳品中的丙酸桿菌素非常適合作為生物防腐劑作用于食品中，我國對丙酸桿菌素的應用研究較少，因此本研究為丙酸桿菌素的工業化生產作了一定鋪墊，將對推動丙酸桿菌素的應用起一定作用，將激發其作為新型綠色安全防腐劑的潛力。