副溶血性弧菌廣譜裂解性噬菌體的篩選及其在海產品安全控制中的應用

鄭小雙 ，高 璐,2，張 輝，饒勝其,2，楊振泉,2,*

（1.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225009；2.揚州大學 江蘇省人獸共患病學重點實驗室，江蘇 揚州 225009；3.江蘇省食品質量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地，江蘇省農業科學院農產品質量安全與營養研究所，江蘇 南京 210014）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是引起海產品食物中毒的主要病原菌[1-2]。該菌為嗜鹽菌，主要分布于海洋動物的表面組織、海底沉積物及海水中[3-4]，因此在海產食品中此菌檢出率很高。食用被該菌污染的海產品后，極易引起急性腸胃炎[5]和敗血癥[6]，隨著現代海產品貿易和物流配送體系的完善，海產品的消費量逐年增加，該菌引發食源性致病菌的風 險和暴露人群也在不斷升高[7-8]。傳統的化學保鮮劑雖然具有良好的抑菌效果，但殘留高，不利于人體健康[9]。因此，開發新型的高效、無毒、廉價的天然抑菌劑用于控制海產品養殖、加工、保藏過程中致病菌的載量，符合 人們對綠色產品的需求。噬菌體是細菌的病毒，能夠專一性地裂解宿主菌，作用機理明確，具有對人體和動物安全等特點[10-11]。另一方面，噬菌體數量龐大[12]，易于篩選，成本低廉，十分適合用于海產品等易腐敗食品中主要病原菌的控制。

本研究以42 株不同來源致病性Vp為宿主菌，從江蘇省揚州不同地點采集的污水樣品中分離裂解型噬菌體，分析其形態、裂解譜、p H值及溫度穩定性、抗性突變頻率等生物學特征，并以人工污染的黃魚作為模型，研究多噬菌體混合物對模擬污染黃魚的抑菌效果，為開發廣譜Vp噬菌體抑制劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：42 株Vp分離株均為本室分離并保存。

2216E液體、固體培養基 青島高科園海博生物技術有限公司；TCBS瓊脂 杭州濱和微生物試劑有限公 司。

SM緩沖液：NaCl 5.8 g，MgSO4·7H2O 2 g，明膠0.1 g，50 mL的1 mol/L Tris-HCl溶液（pH 7.5），蒸餾水定容1 000 mL，121 ℃滅菌備用；0.9%生理鹽水由本實驗室自行配制，121 ℃滅菌備用。

1.2 儀器與設備

BDY-2012 恒溫搖床 上海百典儀器設備有限公司；DGX-9053B-2型生化培養箱 上海?，斣O備有限公司；PHS-3C pH計 上海精密科學儀器有限公司；DICO型臺式離心機 美國Thermo Fisher公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tommy公司；Tecnai-12透射電鏡荷蘭Philips公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養

將－70 ℃菌種保存液在4 ℃解凍后，取100 μL接種于5 mL 2216E液體培養基，37 ℃、150 r/min培養6 h后TCBS瓊脂培養基上劃線，37 ℃培養18 h，挑取單菌落接種于5 mL 2216E液體培養基中，37 ℃、150 r/min培養6 h，放置室溫備用。

1.3.2 樣品采集

45 份污水樣品采集自江蘇省揚州市3 個農貿市場，置于無菌離心管，4 ℃保存備用；新鮮黃魚購自江蘇省揚州市本地超市。

1.3.3 噬菌體的分離和純化

將污水樣品5 000 r/min離心10 min，取5 mL上清液加入5 mL 2216E液體培養基中，同時加入100 μL對數生長期的Vp宿主菌，37 ℃振蕩培養8 h后5 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜，濾液經梯度稀釋后與宿主菌混合傾注雙層平板，37 ℃培養6～8 h檢測噬菌斑。挑取單個空斑至1 mL SM緩沖液中，4 ℃過夜，用SM緩沖液倍比稀釋噬菌體液，取適宜梯度加入宿主菌制成雙層平板，37 ℃培養6～8 h，重復培養5次，得到純噬菌體備用。

1.3.4 噬菌 體的電鏡觀察

參考文獻[13]，采用磷鎢酸負染色法。取20 μL噬菌體懸液（效價109PFU/mL）滴于復膜銅網上，吸附10 min后取出銅網，空氣中 自然干燥2～3 min；然后用2%的磷鎢酸溶液進行染色，2 min后吸干水分，空氣干燥5 min，用Tecnai-12透射電鏡觀察噬菌體形態。

1.3.5 裂解譜測定

應用點斑法測定噬菌體的裂解譜[14]，取5 mL 2216E半固體培養基加入50 μL宿主菌（108CFU/mL），顛倒混勻后傾倒在固體培養基上，待凝固后，滴加噬菌體懸液（108PFU/mL）10 μL，置培養箱中培養8～12 h，觀察裂解圈的形成。

1.3.6 噬菌體pH值和熱穩定性測定

取100 μL 109PFU/mL的噬菌體液與pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的2216E培養基混合，37 ℃的水浴2 h，測定噬菌體的效價，每組實驗重復3 次。取0.5 mL的噬菌體（109PFU/mL），分別于50、60、70、80 ℃水浴作用20、40 min和60 min，作用結束后取樣，測定噬菌體的效價，每一溫度設3 個平行。取平均值用于分析噬菌體pH值和熱敏感性。

1.3.7 最佳感染復數（multiplicity of infection，MOI）測定

噬菌體懸液（109PFU/mL）梯度稀釋，與對數期的宿主菌液（108CFU/mL）按照MOI為0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100的比例混合，加入10 mL的2216E液體培養基中，37 ℃、150 r/min培養6 h；取1 mL培養液8 000 r/min離心10 min，取上清液測定噬菌體的效價，選擇效價最高的MOI為最佳MOI。

1.3.8 一步生長曲線測定

一步生長曲線的測定采用Lu等[15]改進的方法。將噬菌體懸液（109PFU/mL）與對數期宿主菌懸液（108CFU/mL）按照MOI大于 10的比例加入 到2216E液體培養基，37 ℃恒溫孵育10 min，12 000 r/min離心30 s，用2216E液體培養基洗滌沉淀3 次；然 后加入等體積預熱的2216E液體培養基，37 ℃、150 r/min振 蕩培養，每隔10 min取樣，測定噬菌體效價（lg（PFU/mL））。以時間為橫坐標、噬菌體效價為縱坐標，繪制噬菌體的一步生長曲線。裂解量按裂解末期噬菌體的效價與裂解初期宿主菌的濃度比值進行計算。

1.3.9 噬菌體不敏感突變頻率的測定

參考文獻[16]所述方法測定噬菌體不敏感突變頻率（bacteriophage insensitive mutants frequency，BIMF）。分別取新鮮培養的Vp菌懸液（105CFU/mL）和相應噬菌體懸液（108PFU/mL）各100 μL混合，混合噬菌體BIMF測定取5 株噬菌體（107PFU/mL）制成的混懸液（VppMIX）和相應5 株宿主菌混合菌液（105CFU/mL）各100 μL混合，在混合體系中加入 CaCl2（0.01 mol/L）和MgSO4（0.01 mol/L），以不加噬菌體的Vp菌株作為對照，37 ℃靜置培養10 min，梯度稀釋后涂布TCBS平板上，37 ℃培養18 h，計算平皿中噬菌體抗性菌落總數（假定不敏感菌落數）。挑取所有抗性菌落，接種于2216E液體培養基，搖床培養8 h，點斑法測定培養物對噬菌體的敏感性，計算沒有裂解圈的菌株總數（確定不敏感菌落數）。BIMF為確定的不敏感菌落數量與沒有添加噬菌體的菌落數比值。

1.3.10 噬菌體對黃魚中Vp的抑制作用

應用模擬污染的黃魚肉作為模型測定噬菌體對海水魚基質中Vp的抑制作用[17]。采集新鮮黃魚背部肌肉，切成2 cm×2 cm的小塊，先用次氯酸鈉浸泡15 min，撈出瀝干，無菌水漂洗5次，每次3 min，瀝干備用。將魚肉樣品分為4 個處理組（每組30 塊）：實驗組1：噬菌體處理，MOI=10 000；實驗組2：噬菌體處理，MOI=100；實驗組3：噬菌體處理，MOI=1；對照組：空白，沒有噬菌體處理。

將5 種噬菌體液（109PFU/mL）等體積混合制成VppMIX，終體積為500 mL，梯度稀釋到107PFU/mL和105PFU/mL備用。將實驗組和對照組魚塊先用Vp菌懸液（105CFU/mL）浸泡10 min，撈出瀝干；實驗組1、2、3魚塊分別置于109、107、105PFU/mL噬菌體懸液中浸泡10 min，撈出瀝干，裝入聚乙烯薄膜袋中；將對照組魚塊置于等體積的生理鹽水中浸泡10 min，瀝干后裝入聚乙烯薄膜袋中。將所有魚塊放置25 ℃進行恒溫貯藏。分別在0、2、4、6、8 、10、12、18、24 h取魚塊，均質后，用生理鹽水梯度稀釋，涂布TCBS平板，37 ℃培養18 h，人工計數菌落總數（lg（CFU/mL）），每組實驗重復3 次，比較不同處理組的抑菌效果。

1.4 數據處理

采用S P S S 1 7.0軟件對 數據進行方差分析（ANOVA），P＜0.05，差異 顯著；并用Origin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 噬菌體分離純化

從揚州市3 個農貿市場的45 份污水樣品，以42 株Vp菌株作為宿主菌，從其中10 份樣品中分離到15 株烈性噬菌體，噬菌斑裂解圈直徑在1～2 mm之間，存在清澈透明、渾濁、透明圈外有暈環等形態；篩選其中裂解圖清澈透明（圖1）5 株噬菌體（編號為VppYZU64、VppYZU68、VppYZU81、VppYZU92、VppYZU110）進一步研究。

圖1 1 VpVp噬菌體的噬菌斑Fig. 1 Morphology of Vp phages plaques

2.2 噬菌體的微觀形態

圖2 2 VpVp噬菌體透射電鏡照片Fig. 2 Transmission electron micrographs of Vp phages

圖2透射電鏡結果顯示5 株噬菌體呈現不同的微觀形態。VppYZU64頭部呈長多面體對稱，直徑約為90.9 nm，尾部長約136.4 nm；VppYZU68頭部為正多面體結構，直徑約為63.6 nm，尾部長約115.2 nm；VppYZU92頭部為69.2 nm的正多面體結構，有細長而柔軟的尾部，長度約為200 nm。根據國際病毒分類委員會第九次報告所提出的分類準則[18]，這3 種噬菌體屬于長尾噬菌體科（Siphoviridae）。VppYZU81頭部呈正多面體結構，直徑約為55 nm，沒有尾部，屬于蓋噬菌體科（Corticoviridae）；VppYZU110頭部呈正多面體結構，直徑約為87.1 nm，尾部 長約93.1 nm，外圍有一個收縮性的尾鞘，屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae），結果顯示了Vp烈性噬菌體存在形態多樣性。

2.3 噬菌體的裂解譜

應用點斑法測定5 株及其混合懸液噬菌體（VppMIX）對42 株Vp菌株的裂解譜（表1），結果顯示不同噬菌體分離株具有不同的裂解范圍。噬菌體VppYZU68能裂解5 個Vp菌株；VppYZU64能裂解17 個Vp菌株；VppYZU81可以裂解24 個Vp菌株；VppYZU92可以裂解10 個Vp菌株；VppYZU110能裂解23 個Vp菌株。5 株噬菌體混合物VppMIX裂解譜覆蓋了所有Vp菌株。噬菌體對Vp種內菌株的裂解性與菌株來源和毒力基因型并未發現相關性。

表 11 VVpp噬菌體裂解譜Table 1 Lysis spectrum of Vp p haaggeess

2.4 pH值對噬菌體活性的影響

圖3 Vp噬菌體的pH值穩定性Fig. 3 pH stability of Vp phages

如圖3所示，pH值對噬菌體的活性具有影響，5 株噬菌體在pH 4～10之間保持較高活性；當pH值超過10時，效價均呈現不同程度下降。VppYZU64在pH 10～12時，效價下降了2.2（lg（PFU/mL））（圖3A）。VppYZU92在pH 9～12時，效價下降了2.0（lg（PFU/mL））（圖3D）；VppYZU110在pH值為12時，效價降到0（lg（PFU/mL））（圖3E），呈現較高的堿不穩定性。所有噬菌體在pH值不大于3或大于13時，效價均為0。

2.5 溫度對噬菌體活性的影響

圖4結果顯示，所有噬菌體在50 ℃作用60 min效價保持不變；在60 ℃作用40 min以后，效價緩慢下降；在70 ℃作用，效價均急劇下降，其中VppYZU1 10在20 min后已經完全失活（圖4E）；大多數噬菌體對80 ℃處理敏感，VppYZU68、VppYZU92在20 min后已測不出活性（圖4B、D），但VppYZU64和VppYZU81在80 ℃處理20 min時仍保持微弱活性（圖4A、C）。

圖4 噬菌體的熱穩定性Fig. 4 Thermal stability of Vp phages

2.6 噬菌體的最佳MOI

以不同濃度（103～108PFU/mL）噬菌體感染Vp宿主菌（106CFU/mL），測定培養后噬菌體效價，測定的最佳MOI如表2所示。結果顯示：VppYZU64、VppYZU68、VppYZU81、VppYZU92、VppYZU110的最佳MOI分別為0.1、0.001、1、0.1、0.1。

表2 Vp噬菌體的最佳MOITable 2 Optimum MOI of Vp phages

2.7 噬菌體的一步生長曲線

圖5 5 VpVp噬菌體一步生長曲線Fig. 5 One-step growth curve of Vp phages

如圖5所示，所有噬菌體的增值規律均呈典型的S型曲線，具有明顯的潛伏期、爆發期和平臺期。根據一步生長曲線估算的噬菌體的潛伏時間、爆發時間和裂解量結果如表3所示，VppYZU64裂解量最高達到150 PFU/cell，但潛伏期較長為40 mi n，VppYZU68、VppYZU81裂解量分別為87、20 PFU/cell，潛伏期分別為20 min和30 min，VppYZU92、VppYZ U110顯示了較短的潛伏期，均為10 min，裂解量分別為35 PFU/cell和58 PFU/cell。

表 33 VVpp噬菌體的裂解特征Table 3 Lysis properties of Vp phaaggeess

2.8 噬菌體BIMF

不敏感突變體的出現，降低了噬菌體裂解宿主菌的能力，通常與細菌細胞表面編碼受體分子的基因點突變有關[19]，多糖等的產生遮蔽了受體，從而抑制噬菌體吸附。測定5 株噬菌體及其混合物的BIMF，結果如表4所示。單一噬菌體的BIMF差異性較大；VppYZU81比VppYZU64的BIMF高100 倍，這種差異可能是由于噬菌體的吸附受體不同[20-21]。VppMIX的BIMF值最小，為3.50×10－6，顯著低于單一噬菌體。結果表明噬菌體混合物可以克服噬菌體抗性突變體的生長缺陷。

表4 不同噬菌體BIMFTable 4 Frequencies of Vp spontaneous phage resistant mutants

2.9 VppMIX對海魚中致病性Vp的抑制作用

應用Vp模擬污染的黃魚作為模型評價VppMIX對Vp的抑制效果，結果如圖6所示。Vp菌懸液污染的魚片25 ℃保存5 h，菌落數由起始的4.13（lg（CFU/g））上升到5.60（lg（CFU/g）），而VppMIX處理的魚片中Vp總數下降至2.0（lg（CFU/g））（MOI=1，實驗組3）、1.35（lg（CFU/g））（MOI=100，實驗組2）以及0.93（lg（CFU/g））（MOI=10 000，實驗組1）；在25 ℃貯藏12 h，噬菌體處理組的Vp總數分別達到7.51（lg（CFU/g））（MOI=1，實驗組3）、5.40（lg（CFU/g））（MOI=100，實驗組2）以及3.94（lg（CFU/g））（MOI=10 000，實驗組1），均顯著小于對照組8.92（lg（CFU/g））（P＜0.01）。結果表明高濃度噬菌體混合物VppMIX可以有效抑制魚片中多個致病性Vp株的生長，高濃度處理更有利于Vp的失活。

圖6 混合噬菌體VppMIX在模擬污染魚塊中的抑菌效果Fig. 6 Inactivation of Vp in arti ficially contaminated fish fillet by phage cocktail VppMIX

3

討 論

噬菌體在食品及公共環境領域控制病原菌污染及危害具有良好的應用前景[22]。分離篩選廣譜高效的噬菌體分離株對構建高效的生物減菌劑具有重要價值。本研究從污水樣品中篩選致病性Vp的烈性噬菌體，獲得了5 株噬菌體具有較寬的抑菌譜及良好的耐熱能力，以及較廣的pH值生存范圍，為進一步研發食品加工溫度和酸堿度下噬菌體減菌劑提供了分離株。

噬菌體大量存在于含有其宿主菌的環境中，目前分離到的Vp噬菌體形態主要屬于肌尾噬菌體科[23]、長尾噬菌體科[24]、短尾噬菌體科[25]。本研究發現5 株噬菌體分離株分別屬于這3 個科，且針對同一個Vp宿主菌株的噬菌體存在不同形態，同一噬菌體可以對不同毒力基因型和來源的Vp產生裂解活性。查濤等[26]研究發現噬菌體對不同血清型宿主菌表現出不同的裂解特征，產生不同形態的噬菌斑，但本研究中并未發現裂解特征與菌株基因型具有明顯相關性。結果表明自然界Vp噬菌體存在高度多樣性，其裂解性與宿主菌來源無關[27]。

不敏感突變體的出現直接影響噬菌體的抑菌效果，不同噬菌體單株產生抗性突變頻率（BIMF）變化很大，而噬菌體混合物的應用可以有效降低BIMF[28]，擴大裂解宿主范圍。O’Flynn等[20]研究表明較低的BIMF（10－6）并不影響將噬菌體用作生物控制劑，這與本研究的結果一致。本研究構建的5 株Vp烈性噬菌體混合制劑VppMIX，不敏感突變株的產生頻率降低到10－6以下，對42 株Vp菌株均具有裂解作用，拓寬了抑菌譜。Alagappan等[29]得到了相似的結論，與單獨使用相比，3 株Vp噬菌體混合物明顯降低了蝦的死亡率。本研究魚肉抑菌實驗結果表明，VppMIX可以在25 ℃貯藏溫度下有效抑制魚肉基質中Vp增殖，并且生物抑菌效果呈劑量依賴性，與文獻報道一致，較高的噬菌體濃度通常會導致更多的細菌失活[30-31]。