靈芝在牛蒡固體培養基中發酵工藝優化及菌絲多糖的體外抗氧化活性

董玉瑋，周 潔，苗敬芝，李 文，胡傳銀

（1.徐州工程學院食品（生物）工程學院，江蘇 徐州 221018；2.徐州天馬敬安食品有限公司，江蘇 徐州 221636）

牛蒡（Arctium lappa L.）俗稱東洋參，為菊科兩年生草本植物，主要分布于北歐、西伯利亞和中國東北地區，我國江蘇徐州和山東地區種植歷史最為悠久。牛蒡的根莖粗大肥碩，含有豐富的粗纖維，含量位居地下根莖類蔬菜中之首，同時富含蛋白質[1]、多糖[2]、纖維素[3]、黃酮苷[4]等營養成分，是藥食兩用健康食品，已在新型、功能型深加工產品、制藥、保健品等方面形成了較多研究成果[5-7]。

長勢好、品質佳的牛蒡一般作為出口、生產深加工產品的原料，但也有部分品質較低的牛蒡被丟棄，無法再利用，造成浪費和生產企業的損失。導致這一現象的主要原因是牛蒡本身，以及作為廢棄物的牛蒡根皮、葉等，由于含有大量纖維素，難以再利用。提高低品質牛蒡的利用效率，最大化挖掘并提升牛蒡廢棄物的價值，將有利于提高企業生產效益。微生物尤其是一些藥食真菌，比如營養、保健價值較高的靈芝、猴頭菇、金針菇等，具有分解、利用纖維素的能力[8]，同時牛蒡根中含有的蛋白質、維生素、礦物質等營養成分[2]也可作為藥食真菌生長的原料，如果以牛蒡作為營養基質固體發酵藥食真菌，則提高了牛蒡、藥食真菌的利用價值，對促進牛蒡產業的可持續發展具有重要的現實意義。

真菌中的靈芝是一種藥食同源的健康滋補食品，分類隸屬于擔子菌門、擔子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝屬，富含萜類、糖類、蛋白質以及多種氨基酸，其中多糖和三萜類含量是衡量靈芝品質的重要標準，在抗炎[9]、抗氧化[10]、抗腫瘤[11-12]、降血糖[13]等方面功效突出。固體發酵靈芝一般以木屑、棉籽殼、麥麩、石膏等作為培養基，如能采用低品質牛蒡固體發酵靈芝，將大大提高牛蒡的利用率，同時節約靈芝固體發酵的成本，有利于牛蒡、靈芝的合理利用以及精深加工產業發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種靈芝購自徐州市銅山縣食用菌科技開發服務中心，經本實驗室鑒定為多孔菌科靈芝（Ganoderma lucidum (Leyss. ex. Fr.) Karst）。經誘變選育后，具有高產多糖的性能，保存于本實驗室；牛蒡由徐州天馬敬安食品有限公司提供，品質低于出口標準。

固體發酵培養基：牛蒡洗凈，去皮后切成小塊，粉碎機粉碎過篩后，按比例加水配制。

乙腈（色譜純）、單糖標準品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、巖藻糖、半乳糖） 國藥集團化學試劑有限公司；葡萄糖、瓊脂粉、三氟乙酸、乙醇、氯仿、正丁醇、硫酸、苯酚等菌種培養、多糖提取和純化所用試劑（均為分析純） 南京晚晴化玻儀器有限公司。

1.2 儀器與設備

FA21040電子天平 北京精密儀器公司；IXQ-SG46-280A手提式壓力蒸汽滅菌鍋 德州市新恩精密糧儀有限公司：FSD-101A電動粉碎機 上海博訊有限公司；250D恒溫光照培養箱 常州國華電器有限公司；GZ202-2電熱恒溫干燥箱 上海躍進醫療器械有限公司；DL-5低速大容量離心機 上海安亭儀器廠；7230G可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；Nicolet iS5傅里葉變換紅外光譜儀 上海力晶科學儀器有限公司；1260液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 靈芝菌種的活化

馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基：按照GB 4789.15—2010《食品衛生微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》配制，用于菌種的活化及保存。

菌種活化：取靈芝菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面培養基上活化1～2 次。

1.3.2 單因素試驗

采用牛蒡固體發酵培養基發酵靈芝，考察液固比、裝瓶量、粉碎程度對固體發酵靈芝菌絲多糖含量的影響，每組實驗重復3 次取平均值。

1.3.2.1 液固比的選擇

粉碎后的牛蒡過8 目篩后，以0.2 g/mL裝瓶量（每毫升培養瓶加入牛蒡質量）將牛蒡裝入100 mL培養瓶中，按照液固比（每克牛蒡加入蒸餾水體積）為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL/g配制固體培養基，無菌接種，封口膜封口，黑暗條件下28 ℃固體發酵培養15～25 d至菌絲長滿培養基，將菌質于50 ℃烘干后粉碎，過60 目篩。

1.3.2.2 裝瓶量的選擇

粉碎后的牛蒡過8 目篩后，按照0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 g/mL的裝瓶量，在100 mL培養瓶中裝入牛蒡，以液固比0.6 mL/g配制固體培養基，無菌接種，封口膜封口，黑暗條件下28 ℃固體發酵培養15～25 d至菌絲長滿培養基，將菌質于50 ℃烘干后粉碎，過60 目篩。

1.3.2.3 粉碎程度的選擇

粉碎后的牛蒡分別過4、6、8、10、12 目篩，以0.2 g/mL裝瓶量將牛蒡裝入100 mL培養瓶中，以液固比0.6 mL/g配制固體培養基，無菌接種，封口膜封口，黑暗條件下28 ℃固體發酵培養15～25 d至菌絲長滿培養基，將菌質于50 ℃烘干后粉碎，過60 目篩。

1.3.3 牛蒡固體發酵靈芝響應面工藝優化

根據Box-Behnken試驗設計原理，采用Design-Expert 8.06試驗設計軟件對牛蒡固體發酵靈芝工藝進行優化，設計3因素3水平響應面試驗，因素和水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels used for Box-Behnken design

1.3.4 菌絲多糖的提取與檢測

提取多糖使用水提醇沉法：將靈芝菌絲烘干粉碎，稱5 g于燒杯中，加入50 mL水混勻，60 ℃水浴1.5 h，4 000 r/min離心5 min，過濾取沉淀，重復提取3 次，合并提取液，置于60 ℃烘箱中濃縮至原體積1/5，濃縮液加入5 倍體積95%乙醇溶液，溶解過夜。4 000 r/min離心10 min，過濾取沉淀為粗多糖，60 ℃烘箱烘干，加入10～50 mL水充分溶解。測定多糖含量采用苯酚-硫酸法，根據標準曲線計算每克干菌絲中粗多糖的含量。

1.3.5 粗多糖的純化

1.3.5.1 脫蛋白、透析

采用Sevag法對粗多糖進行脫蛋白處理。按氯仿-正丁醇體積比4∶1配制Sevag試劑，粗多糖溶液置于分液漏斗中，加入1/5溶液體積的Sevag試劑，振蕩20 min，4 000 r/min離心10 min得上清液，繼續重復上次操作，直至氯仿層與正丁醇層之間沒有乳白色變性蛋白質析出為止，合并上清液，倒入截流相對分子質量為6 000～8 000的半透膜袋中，蒸餾水透析48 h，期間每2 h更換一次水。

1.3.5.2 脫色

取透析后的多糖配制成5 mg/mL的溶液50 mL，加入30% H2O21 mL，50 ℃保溫脫色3 h，直至色值不再降低，濃縮后凍干得多糖純品。

1.3.6 紅外光譜分析

將純化后的多糖，與KBr粉末混合，置于瑪瑙研缽中，研磨均勻，經壓片機壓片后，紅外光譜上機掃描，波數4 000～400 cm－1，分辨率位8 cm－1，掃描次數64。采用Omnic 8.2分析軟件采集紅外光譜圖。

1.3.7 單糖組成分析

1.3.7.1 酸水解

稱取凍干的多糖樣品2 mg，加入2 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL，在120 ℃條件下水解120 min。氮吹儀吹干。

標準品處理：配制10 mg/mL單糖標準品，放置于－20 ℃。用時取出融化，在密封的玻璃管中加入上述單糖標準品各5 μL，混勻。再加入2 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL，與樣品同時在120 ℃條件下水解120 min。空氣泵吹干。

1.3.7.2 PMP衍生化

向水解干燥后得到的單糖樣品中加入溶于無水甲醇的0.5 mol/L的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）試劑和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL，充分混勻后，水浴70 ℃反應30 min。冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl溶液0.5 mL，充分混勻。加入0.5 mL氯仿，充分振蕩萃取，5 000 r/min離心5 min去除氯仿層，共萃取3 次。0.22 μm濾膜過濾后，待上機。

1.3.7.3 高效液相色譜分析

色譜柱：SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0.1 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液-乙腈（82∶18，V/V）；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL，波長245 nm。

1.3.8 菌質多糖抗氧化活性測定

1.3.8.1 清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）自由基能力的測定[14]

對DPPH自由基清除率進行測定，空白對照用蒸餾水代替樣品，以VC作為陽性對照。DPPH自由基清除率計算如式（1）所示：

式中：Ac為對照組吸光度；Ai為樣品組吸光度；Aj為空白組吸光度。

1.3.8.2 清除超氧陰離子自由基能力的測定[15]

采用鄰苯三酚自氧化法進行測定，空白對照用蒸餾水代替樣品，以VC作為陽性對照，采用式（1）計算清除率。

1.3.8.3 清除羥自由基能力的測定[16]

采用鄰二氮菲比色法進行測定，空白對照用蒸餾水代替樣品，以VC作為陽性對照。羥自由基清除率計算如式（2）所示：

式中：A1為樣品組的吸光度；A2為樣品參比的吸光度；A3為損傷管的吸光度；A4為未損傷管的吸光度；A0為空白對照組的吸光度。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液固比的選擇

圖1 液固比對牛蒡發酵靈芝工藝的影響Fig. 1 Effect of liquid-to-solid ratio on mycelial polysaccharide production by G. lucidum

由圖1可知，菌絲多糖含量在液固比0～0.8 mL/g范圍內先增加后減少，在液固比為0.4 mL/g時多糖含量達到最高，為24.21 mg/g。

2.1.2 裝瓶量的選擇

圖2 裝瓶量對牛蒡發酵靈芝工藝的影響Fig. 2 Effect of medium-to-culture fl ask ratio on mycelial polysaccharide production by G. lucidum

由圖2可知，菌絲多糖含量在裝瓶量0.1～0.3 g/mL范圍內先增加后減少，在裝瓶量為0.2 g/mL時多糖含量達到最高，為24.33 mg/g。

2.1.3 粉碎程度的選擇

圖3 粉碎程度對牛蒡發酵靈芝工藝的影響Fig. 3 Effects of degree of comminution on mycelial polysaccharide production by G. lucidum

由圖3可知，菌絲多糖含量在牛蒡粉碎后過4～12 目篩范圍內先增加后減少，當粉碎后過8 目篩，多糖含量達到最高，為23.05 mg/g。

2.2 響應面試驗設計結果

根據響應面試驗制定詳細的分析方案，試驗設計與結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Experimental design with predicted and observed results for response surface analysis

2.3 回歸模型的建立和檢驗

對液固比（X1）、裝瓶量（X2）和粉碎程度（X3）3 個單因素進行回歸擬合，得出多糖含量（Y）回歸方程：

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

經響應面軟件分析，預測模型標準偏差為0.19，平均值22.68，變異系數0.83，預測殘差平方和3.05，如表3所示，此模型的擬合程度較好，決定系數R2為0.993 9，P＜0.01，為極顯著水平，說明該方程與實際情況相符，具有可靠性。失擬項P值大于0.05，不顯著。液固比、裝瓶量、粉碎程度的P值都小于0.01，對多糖含量都有極顯著影響。液固比和裝瓶量兩兩交互作用對多糖含量的影響不顯著，液固比和粉碎程度、裝瓶量和粉碎程度兩兩交互作用對多糖含量有顯著影響。

2.4 響應面分析

圖4 各因素交互作用響應面和等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots showing the interactive effects of factors

由圖4可知，交互影響作用大小排序為：液固比與粉碎程度＞裝瓶量與粉碎程度＞液固比與裝瓶量。3因素對多糖含量的影響大小依次為：粉碎程度＞裝瓶量＞液固比。回歸模型確定的最佳發酵工藝為液固比0.39 mL/g、裝瓶量0.19 g/mL、粉碎程度6 目，預測得到的多糖含量最高為24.93 mg/g。對此優化條件進行驗證，考慮實際操作，選擇液固比0.4 mL/g、裝瓶量0.2 g/mL、粉碎程度6目條件下進行3 次驗證實驗，提取的多糖平均含量為24.85 mg/g，和預期結果基本相符，回歸模型的預測性能較好，可用于優化牛蒡固體發酵靈芝工藝。

2.5 菌絲多糖紅外光譜檢測結果

圖5 牛蒡固體發酵靈芝菌絲多糖紅外光譜檢測圖Fig. 5 Infrared spectrum of mycelial polysaccharide from G. lucidum

從圖5可知，牛蒡固體發酵靈芝菌絲多糖具有典型的多糖特征吸收峰，3 343 cm－1處有強的—OH伸縮振動吸收峰，2 930 cm－1處有強的—CH3、—CH2、—CH等的—CH伸縮振動吸收峰，1 714 cm－1和1 633 cm－1處為羧基和酰胺基的振動吸收峰，1 416 cm－1有—CH變角振動吸收峰，1 329 cm－1和1 270 cm－1分別為—OH和—CH的變角振動吸收峰，1 217 cm－1處有—COOH中—OH變角振動吸收峰，1 158 cm－1和1 127 cm－1有吡喃糖環醚鍵中的C—O伸縮振動，1 029 cm－1處的則是醇羥基的變角振動吸收峰，935 cm－1處為吡喃型糖環特征吸收峰，988 cm－1和875 cm－1處存在β-型糖苷鍵的振動吸收峰，875 cm－1和818 cm－1處是甘露糖的振動吸收峰。

2.6 單糖組成分析

圖6 單糖標準品的PMP柱前衍生高效液相色譜Fig. 6 HPLC profiles of monosaccharide standards with PMP pre-column derivatization

結合圖6、7結果，經計算，每100 g牛蒡固體發酵靈芝菌絲多糖中，單糖組成主要為5.01 g甘露糖、0.67 g鼠李糖、0.66 g葡萄糖、1.54 g半乳糖、0.58 g木糖、1.27 g阿拉伯糖和0.22 g巖藻糖。

圖7 牛蒡固體發酵靈芝菌絲多糖的PMP柱前衍生高效液相色譜Fig. 7 HPLC profiles of mycelial polysaccharide from G. lucidum with PMP pre-column derivatization

2.7 體外抗氧化活性分析

2.7.1 清除DPPH自由基的能力

圖8 菌絲多糖和VC對DPPH自由基的清除效果Fig. 8 Scavenging effects of mycelial polysaccharide from G. lucidum and VC on DPPH radical

由圖8可知，菌絲多糖對DPPH自由基清除效果明顯，在0～1 mg/mL范圍內呈現量效關系，當菌絲多糖質量濃度為0.5 mg/mL時，清除率已經達到69.34%，說明菌絲多糖對DPPH自由基具有較好的清除能力。

2.7.2 清除超氧陰離子自由基的能力

圖9 菌絲多糖和VC對超氧陰離子自由基的清除效果Fig. 9 Scavenging effects of mycelial polysaccharide from G. lucidum and VC on superoxide anion radical

由圖9可知，菌絲多糖對超氧陰離子自由基清除效果明顯，在0～1 mg/mL范圍內呈現量效關系，當菌絲多糖質量濃度為0.5 mg/mL時，清除率已經達到65.78%，說明菌絲多糖對超氧陰離子自由基具有較好的清除能力。

2.7.3 清除羥自由基的能力

圖10 菌絲多糖和VC對羥自由基的清除效果Fig. 10 Scavenging effects of mycelial polysaccharide from G. lucidum and VC on hydroxyl radical

由圖10可知，菌絲多糖對羥自由基清除效果明顯，在0～1 mg/mL范圍內呈現量效關系，當菌絲多糖質量濃度為0.5 mg/mL時，清除率已經達到66%，說明菌絲多糖對羥自由基具有較好的清除能力。

3 討 論

3.1 牛蒡固體發酵靈芝工藝的優勢

3.1.1 固體發酵工藝的優勢

本研究所選擇的固體發酵工藝，其培養基為固態且缺少以連續相存在的水，相對于液體發酵工藝，設備簡單、經濟、能耗低，技術成本不高，后續處理過程也較為簡便，易于產業化推廣。同時由于固體發酵環境與大部分真菌在自然狀態下的生長環境更為接近，因此也更有利于發酵活性產物的積累，而液體發酵由于含水量增加，會影響菌種的生理代謝過程，進而影響活性物質的組成與活性。例如盛悅等[17]對比了猴頭菌液體、固體發酵產物多糖抗氧化活性后發現，固體發酵產物多糖抗氧化活性略優于液體發酵；段金柱等[18]對比了固體發酵與液體發酵生產纖維素酶的產率與催化性能，固體發酵在產量、質量和大規模生產方面均優于液體發酵。

3.1.2 以牛蒡為培養基固體發酵的優勢

品質較低的牛蒡粗細不均、易彎曲易折斷、口感差，在傳統牛蒡加工過程中，不但不能作為出口原料，甚至會被作為廢棄物處理，無法再利用，造成極大浪費。由于牛蒡中木質素、纖維素含量較高，并含有多糖、維生素、氨基酸等成分，為靈芝等藥食真菌固體發酵提供了適宜的營養基質。采用低品質牛蒡固體發酵靈芝，菌絲生長速度、菌絲多糖含量與傳統固體發酵無明顯差異，工藝簡單，可操作性強，不需額外添加化學試劑，既節省了原料和成本，又合理利用了牛蒡。目前本實驗室已經利用低品質牛蒡，成功液體發酵了毛木耳、茶新菇、平菇，固體發酵了茶薪菇、金針菇、杏鮑菇等多個品種食用菌，顯示出牛蒡在液體、固體發酵藥食真菌中具有普遍的規律性和適用性，相關工藝技術已在藥食真菌發酵、牛蒡綜合利用、植物-藥食真菌復合型飲料制備方面開展了系列應用，符合現代綠色、高效農業的理念，具有很好的推廣前景。

3.1.3 牛蒡固體發酵靈芝多糖產量的優勢

對比采用木屑培養基[19]，其組成為（質量百分比）木屑85%、麥麩12%、黃豆粉2%、石膏粉1%，液固比為1.5 mL/g，28 ℃固體發酵靈芝12 d后，測定多糖含量為（8.71±1.29） mg/g。付銘等[20]采用大米為基質，固體發酵靈芝；生東明等[21]采用麩皮、蔗糖為培養基，固體發酵靈芝；周小蘋等[22]采用麥芽汁和茶葉固體發酵靈芝，均測定了菌絲體多糖含量。本研究在最佳工藝條件下牛蒡固體發酵靈芝后，多糖含量為24.85 mg/g，經比較后可知，高于木屑培養基和生東明等[21]的測定結果，但是低于付銘[20]、周小蘋[22]等的研究結果，說明牛蒡固體發酵靈芝，多糖產量適中，適合進一步產業化推廣。

3.2 牛蒡固體發酵靈芝菌絲多糖中單糖組分特點

于華崢[23]、黃靜涵[24]等及馮勝平[25]曾對靈芝多糖中單糖組成進行過研究，Carlotto等[26]曾對牛蒡多糖中單糖組成進行過分析，經對比后發現，牛蒡固體發酵靈芝菌質多糖中單糖種類和數量未超出已報道的，但是各單糖所占比例則有所差異。Ai-Lati等[27]研究發現靈芝多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖組成，其中葡萄糖占比最高，為92.33%；鄭一美等[28]報道牛蒡多糖中單糖由果糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，其中果糖含量最大，達到9.35%。本研究所獲得的牛蒡固體發酵靈芝菌絲多糖，經紅外光譜分析可知，在400～4 000 cm－1范圍，具有糖類的特征吸收峰；經液相色譜分析發現，其單糖組成中甘露糖占比最高，為50.35%，是葡萄糖的7.6 倍，未檢測出果糖成分。含量上的差異可能意味著靈芝重新分解與合成了牛蒡中的營養物質，使得多糖中單糖組成比例發生了較大變化。甘露糖作為目前被用于臨床上的一種糖質營養素，能直接被利用合成糖蛋白，參與免疫調節，具有調節免疫系統的作用，提示本實驗所制備的牛蒡固體發酵靈芝菌質多糖具有較好的優勢和進一步利用的前景。

3.3 牛蒡固體發酵靈芝菌絲多糖的抗氧化能力

Tian Xing等[29]研究發現，牛蒡提取物能夠減少脂質過氧化產物丙二醛的產生，防止活性氧的生成，具有較強的自由基清除能力，對過氧化氫誘導的細胞損傷有保護作用；靈芝水提物和靈芝多糖也具備清除DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的能力[30-32]。本研究發現，牛蒡固體發酵靈芝菌質多糖也具有相似的抗氧化能力。在質量濃度大于0.5 mg/mL時，菌質多糖表現出對3 種自由基都有較好的清除作用，且隨質量濃度增大而增大。說明牛蒡固體發酵靈芝菌質多糖具有一定的還原能力，通過發生氧化還原反應，DPPH自由基、超氧陰離子自由基被還原，同時菌質多糖碳氫鏈上的氫原子能迅速與羥自由基結合成水，多糖的碳原子上留下一個成單電子，成為碳自由基，經進一步氧化形成過氧自由基，最后分解成對機體無害的產物，達到對3 種自由基清除的作用。

4 結 論

通過響應面設計優化提取工藝，得出最佳方案為液固比0.4 g/mL、裝瓶量0.2 g/mL、粉碎程度6 目，在此條件下，多糖含量的最大值為24.85 mg/g。紅外光譜掃描結果表明，牛蒡固體發酵靈芝菌絲多糖具有糖類的特征吸收峰，單糖間連接方式以β-糖苷鍵為主。高效液相色譜檢測菌質多糖單糖組成為甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖等，其中甘露糖含量最高，為50.35%，是葡萄糖的7.6 倍。體外抗氧化性檢測表明，牛蒡固體發酵靈芝菌絲多糖對DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基都具有清除能力，清除率均大于70%，說明多糖具有較好的體外抗氧化活性。