臍橙全果酒發酵工藝優化及其與臍橙果汁酒風味物質的對比分析

鄭淑丹，陳 鋼*，闕發秀，萬 聆，鄧山鴻，簡素平

（南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047）

臍橙譽為“柑橘之王”，其果肉顆粒飽滿，鮮嫩多汁，濃甜芳香，營養成分豐富，適用于深加工。我國臍橙產量豐盛，但成熟期較集中、不易貯存，再加上我國臍橙加工業不發達，目前仍以鮮食和橙汁加工為主[1]，導致大量臍橙腐爛變質，造成嚴重浪費，限制了我國臍橙產業的發展[2]。

以臍橙果汁為原料釀造的果酒，乙醇體積分數較低，口感清爽，醇厚柔和，酒香綿長[3]。臍橙果酒充分地汲取了其原有的功能成分，如維生素、類黃酮、類胡蘿卜素等，更利于人體吸收，具有降低膽固醇、延年益壽、保健養顏等功效[4-5]。另外，在果酒的發酵過程中，微生物將臍橙中的還原糖轉化合成多種醇、酯、萜烯類等物質，增加了臍橙的營養價值并改善了風味，臍橙果酒的研究也越來越受到重視。有研究表明，臍橙果皮中存在的香氣物質種類和含量頗為豐富[6]。因此，本研究以臍橙全果為原料，進行臍橙全果酒發酵工藝的優化，并與臍橙果汁酒進行風味物質的比較，從而為臍橙全果酒的工業化生產提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臍橙 江西省贛州地區信豐市；臍橙果汁酒 實驗室自釀；白砂糖（食品級） 深圳安泰生物科技有限公司；葡萄酒、果酒專用酵母（SY） 安琪酵母股份有限公司；果膠酶（酶活力＞50 000 U/g） 上海源聚生物科技有限公司；偏重亞硫酸鉀（食品級） 長沙科迪亞實業有限公司；3-辛醇（色譜純） 美國Sigma公司；β-環糊精（分析純） 廣州一碼生物有限公司。

1.2 儀器與設備

HR1882型榨汁機 飛利浦（中國）投資有限公司；MP2002電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；WYT-J型手持糖度計 成都光學廠；SPX-250B-Z型生化培養箱 上海博迅實業有限公司；pH S22型數顯酸度計 德國Sartorius公司；酒精計 上海精密科學儀器有限公司；VS-1300型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；微量移液器 上海熱電儀器有限公司；5975-6890N氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀 美國Agilent公司；二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程[7-8]

1.3.2 操作要點[7-8]

預處理：選取新鮮成熟的臍橙，清洗干凈，切成小瓣，并去除種子。

榨汁：將處理好的臍橙全果進行榨汁作為發酵液。

酶解、脫苦：加入質量分數0.3%的果膠酶和0.3%的β-環糊精，45 ℃恒溫水浴攪拌1 h。

調配：添加60 mg/L的偏重亞硫酸鉀，用白砂糖調節發酵液含糖量至22%，用檸檬酸和碳酸氫鈉調整發酵液的pH值至3.5～4.5。

酵母活化：取發酵液體積3%～8%的干酵母，加入料液比1∶20（g/mL）的糖水，于38 ℃活化1 h。

主發酵：加入活化好的酵母，放置在生化培養箱中恒溫（25～29 ℃） 密封發酵8～18 d，直至殘糖量低于4 g/L為止。

后發酵：主發酵完成后，采用虹吸法將果酒轉移到另一發酵容器中，盡量避免酒與氧的接觸，補加50 mg/L的偏重亞硫酸鉀，在20 ℃密封靜置15～20 d。

陳釀：將發酵后的臍橙果酒轉入貯酒罐進行陳釀，于16 ℃滿罐放置60～80 d，每隔25 d倒罐1 次，以分離沉渣及酒腳。

澄清、過濾：陳釀后的臍橙酒中加入1%殼聚糖-0.1%明膠對臍橙酒進行澄清處理，用量為0.6 g/L，隨后進行過濾。

1.3.3 臍橙果汁酒的釀制

將臍橙果肉經過榨汁、過濾處理得到的臍橙果汁作為發酵液，其后續工藝流程和上述一致。

1.3.4 臍橙全果酒發酵條件的單因素試驗設計

1.3.4.1 接種量的影響

在臍橙發酵液中分別接種3%、4%、5%、6%、7%、8%的釀酒酵母，28 ℃發酵12 d，以乙醇體積分數和殘糖量為評價指標，探討釀酒酵母接種量對臍橙全果酒發酵效果的影響。

1.3.4.2 發酵時間的影響

臍橙發酵液中釀酒酵母接種量6%，發酵溫度28 ℃，分別發酵8、10、12、14、16、18 d，以乙醇體積分數和殘糖量為評價指標，探討發酵時間對臍橙全果酒發酵效果的影響。

1.3.4.3 發酵溫度的影響

臍橙發酵液中果酒干酵母接種量6%，分別在25、26、27、28、29、30 ℃不同溫度條件下進行發酵，發酵12 d，以乙醇體積分數和殘糖量為評價指標，探討發酵溫度對臍橙全果酒發酵效果的影響。

1.3.5 響應面優化試驗

通過對單因素試驗結果分析，采用Box-Behnken響應面設計分析方法[9-11]，選擇酵母接種量、發酵時間、發酵溫度3 個因素進行響應面試驗，以乙醇體積分數為響應值進行優化，所有試驗均重復3 次，因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.6 理化指標測定[12]

乙醇體積分數的測定：酒精計法；糖度的測定：手持折光儀法；殘糖量的測定：斐林試劑滴定法；SO2的測定：直接碘量法；pH值的測定：采用PHS22型酸度計。理化指標重復測定3 次。

1.3.7 GC-MS條件[13-14]

將固相微萃取萃取頭在GC-MS儀的進樣口老化，老化溫度250 ℃，老化時間30 min，載氣流速1.0 mL/min。取10 mL臍橙酒樣于25 mL螺口進樣瓶中，加入內標物3-辛醇（400 μg/L）5 μL和0.1 g/mL NaCl溶液，密封置于45 ℃水浴中平衡30 min。平衡后插入經過老化處理的固相微萃取頭，頂空萃取40 min后，再將萃取頭插入GC進樣口，解吸5 min。

色譜條件[15-16]：色譜柱DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 mm）；升溫程序：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min的速率升到160 ℃，保持2 min，然后以8 ℃/min的速率升至230 ℃，保持3 min；He流量1.0 mL/min；無分流進樣；進樣口溫度：250 ℃；

質譜條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；電子能量70 eV；燈絲發熱電流0.25 mA；掃描質量范圍m/z33～450。

1.3.8 香氣成分分析[17]

定性分析：運用計算機譜庫（NIST/WILEY）對所得結果進行初步檢索及資料分析，并結合相關文獻進行定性分析。

定量分析：采用內標法，內標物為3-辛醇（400 μg/L），按下式計算：

式中：Wi為揮發性風味化合物質量濃度/（μg/L）；Ws為加入內標物質量/μg；Ai為待測組分的峰面積；As為內標物的峰面積；fi’為待測組分對內標物的質量相對校正因子。

1.3.9 感官評定

參照GB/T 10220—2012《感官分析方法學總論》要求組建感官評定小組（20 人）[18]，參考GB/T 15038—2006《葡萄酒果酒通用試驗方法》制定評分標準，并依據該標準對臍橙果酒進行感官評分，取其平均值作為評分結果。感官評分標準見表2。

表2 臍橙酒感官評分標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of navel orange wine

2 結果與分析

2.1 臍橙全果酒發酵條件的單因素試驗結果

2.1.1 酵母接種量的影響

圖1 酵母接種量對果酒乙醇體積分數和殘糖的影響Fig. 1 Effects of inoculum amount on ethanol production and residual sugar concentration

如圖1所示，酵母接種量低于5%時，其自身繁殖代謝緩慢，果酒殘糖量偏高且乙醇體積分數偏低，發酵不徹底。當酵母接種量為6%時，乙醇體積分數和殘糖量分別達到最大值和最小值。由此可見，酵母接種量越大，果酒乙醇體積分數越高，糖分解轉化率越高，乙醇體積分數也越高。但是，過大的接種量會使酵母自身的呼吸和繁殖加快，消耗過多的糖分，發酵液中用于生成乙醇的糖分便會相應減少。并且由于營養成分的消耗以及代謝物的生成，降低了酵母發酵環境的質量，從而導致酵母的早衰和自溶，使果酒的乙醇體積分數下降[19-20]。

2.1.2 發酵時間的影響

發酵時間短，酵母活力沒有充分發揮作用而導致發酵不完全，發酵液殘糖量偏高，乙醇體積分數較低。如圖2所示，隨著發酵時間的延長，發酵液殘糖量逐漸降低，乙醇體積分數逐漸上升。發酵前8 d，殘糖量下降以及乙醇體積分數增長速度均較快。發酵到第14天時，乙醇體積分數達到11.2%，殘糖量降為3.7 g/L 左右，基本達到發酵終點，隨后便趨于穩定狀態。

圖2 發酵時間對果酒乙醇體積分數和殘糖的影響Fig. 2 Effects of fermentation time on ethanol production and residual sugar concentration

2.1.3 發酵溫度的影響

圖3 發酵溫度對果酒乙醇體積分數和殘糖的影響Fig. 3 Effects of fermentation temperature on ethanol production and residual sugar concentration

酵母的生長繁殖和溫度密切相關，其直接影響果酒的品質。溫度太低會使酵母的生長受到抑制，糖降解速率偏低，發酵時間偏長，且發酵不充分[21]。在一定的范圍之內，溫度越高，酵母的生長速率越快，酶活力越高，所需發酵時間相對縮短。但是，溫度太高會使果酒風味物質流失，并產生不良的發酵味，從而使果酒的品質和口感下降[22]，其可能是因為高溫會使發酵前期太過劇烈，以致后期發酵力不足。如圖3所示，當主發酵溫度為28 ℃時，發酵平穩且徹底，易于控制，果酒口感和品質較佳，所需發酵時間也適中。

2.2 臍橙全果酒發酵條件的響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗設計及結果

參照單因素試驗結果，選擇發酵溫度（A）、酵母接種量（B）、發酵時間（C）各因素的最優試驗范圍進行Box-Behnken試驗設計，以乙醇體積分數為響應值，響應面試驗結果如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 3 Box-Behnken design with experimental values of ethanol production

利用Design-Expert對表3的響應值進行整理分析，確立回歸方程預測模型如下：

2.2.2 方差分析

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance of the fitted regression model

對上述二次回歸方程進行方差分析，所得結果見表4。可以看出，此模型極顯著（P＜0.000 1），并能較好地反映出臍橙全果酒乙醇體積分數和各因素之間的線性關系（R2=0.983 1）；調整系數R2Adj為0.961 4，表明此模型擬合程度較好；失擬項不顯著（P＞0.05），可以用此模型對臍橙全果酒進行分析預測。一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.01），表明這幾個因素對臍橙全果酒乙醇體積分數影響較大。根據F值的大小，各因素對臍橙全果酒乙醇體積分數的影響程度為：酵母接種量＞發酵溫度＞發酵時間。

2.2.3 因素間交互作用分析

圖4 各因素交互作用對果酒乙醇體積分數影響的響應面Fig. 4 Response surface plots showing the interactive effects of various factors on ethanol production

從圖4可知，隨著各因素水平的增加，乙醇體積分數呈現先升高后降低的趨勢，且B對乙醇體積分數的影響要大于A和C。另外，等高線的形狀可以反映出各因素的交互作用對響應值的影響，當等高線為橢圓形時，說明其交互作用顯著，而當等高線為圓形時，其交互作用則不顯著[23]。由圖分析可知，酵母接種量和發酵溫度之間的交互因素較為顯著，這和方差分析結果保持一致。

2.2.4 最佳工藝條件確定

通過Design-Expert V 8.0.6分析可以得出臍橙全果酒的最佳工藝條件為發酵溫度28.28 ℃、酵母接種量6.38%、發酵時間14.40 d，此條件下發酵的臍橙全果酒乙醇體積分數為11.25%。為驗證該方案的可靠性，并結合實際情況，將發酵工藝參數調整為：發酵溫度28 ℃、酵母接種量6.4%、發酵時間14 d。在此條件下進行3 組平行實驗，所得乙醇體積分數分別為11.2%、11.3%、11.2%，平均值為11.23%，與理論預測值僅相差0.08%，表明實驗結果與該模型相符度高。因此，通過響應面分析法優化得到的臍橙全果酒發酵工藝條件準確可靠，參考性較高。

2.3 臍橙全果酒與臍橙果汁酒風味物質的分析比較

香氣成分是果酒感官評定的直接影響因素，也是評價果酒品質特性的重要指標。果酒中的大部分香氣成分是在發酵過程中由酵母代謝產生的，種類豐富，主要包括酯類、醇類、酸類、萜烯類等[24]。果酒中的揮發性成分種類頗豐富，且呈現出不同的香氣，這些香氣物質富集在一起，并相互協調，賦予了果酒濃郁而獨特的風味[25-26]。此外，果酒的發酵工藝條件也會對香氣的成分和含量造成一定的影響。氣味活度值（odor activity value，OAV）反映了香氣成分揮發性的大小及難易程度，能較客觀地體現香氣成分對酒風味的影響[27]。采用頂空固相微萃取并結合GC-MS技術，對兩種臍橙酒中的關鍵風味物質進行了鑒定，在臍橙全果酒和臍橙果汁酒中分別檢出25 種和11 種揮發性香氣物質。通過表5分析可知，臍橙全果酒的香氣活性成分主要為萜烯類，其次為醇類和酯類，而臍橙果汁酒的主要香氣成分為醇類。4-松油烯醇和里哪醇是臍橙全果酒主要香氣成分，而3-甲基-1-丁醇在臍橙果汁酒中含量最豐富。

表5 臍橙果酒風味物質分析Table 5 Flavor components of different navel orange wines

表6 臍橙果酒風味物質的OAV分析Table 6 OAVs of flfl avor components in different navel orange wines

比較這兩種臍橙酒的各類風味物質，發現其在定性和定量上均有所不同。臍橙全果酒中共檢測出9 種醇類物質，占總香氣成分的28.50%。雖然臍橙果汁酒中只檢測出4 種醇類物質，但其含量卻高達91.95%，其中3-甲基-1-丁醇更是臍橙果汁酒香氣成分的主要貢獻者，賦予臍橙酒誘人的水果香和花香，并能夠持久保存[28]。在臍橙全果酒中共含有9 種萜烯類化合物，且所占比例較大（66.00%），除橙花叔醇外，OAV均大于1，香氣特征明顯（表6）。其中，D-檸檬烯和里哪醇被視為臍橙酒的特征香氣成分，嗅覺閾值低，OAV高，賦予臍橙果酒愉悅的甜香、花果香，以及獨特的臍橙風味[29]。然而在臍橙果汁酒中只檢測出一種萜烯類物質（香茅醇），且含量較低（0.27%），風味不突出。酯類物質含量在兩種酒中均不高，且種類上也有很大的差別。癸酸乙酯和辛酸乙酯是兩種酒中共同含有的酯類物質，其含量和OAV在臍橙全果酒中相對高一點，從而使臍橙全果酒的香氣更濃郁。另外，醛酮類物質只在臍橙全果酒中檢測到，雖然其含量較少，但對臍橙酒香氣的呈現起到不可忽視的作用[30]。感官評價方面，臍橙全果酒得分（90.2 分）高于臍橙果汁酒（84.7 分），且在香氣得分上有較明顯的優勢（臍橙全果酒為25.4 分，臍橙果汁酒為21.8 分）。綜合分析看來，臍橙皮和果肉的加入使有更多的原料成分經過發酵融入酒體中，從而增加了臍橙全果酒香氣的種類和含量，對感官評定也有一定的改善。

3 結 論

采用單因素試驗和Box-Behnken試驗設計，通過響應面分析法得到臍橙全果酒最佳發酵工藝條件：酵母接種量6.4%、發酵溫度28 ℃、發酵時間14 d，在此優化條件下，臍橙全果酒的乙醇體積分數為11.23%。此工藝下釀制的臍橙全果酒酒體色澤金黃明亮，口感豐滿圓潤，柔和爽口，香氣濃郁協調，回味綿長，風格突出。

通過頂空固相微萃取GC-MS對臍橙全果酒和臍橙果汁酒風味物質進行鑒定，在臍橙全果酒和臍橙果汁酒中分別檢出25 種和11 種揮發性香氣物質。臍橙全果酒的香氣活性成分主要為萜烯類，占香氣成分的66.00%，其次為醇類和酯類，而臍橙果汁酒的主要香氣成分為醇類，所占比例為91.95%。4-松油烯醇和里哪醇是臍橙全果酒主要香氣成分，而3-甲基-1-丁醇在臍橙果汁酒中含量最豐富。通過分析比較，臍橙全果酒中香氣成分種類更復雜，含量更豐富。綜合感官評價分析，臍橙全果酒優于臍橙果汁酒，其口感更加飽滿醇厚，香氣更加持久濃郁，更具有臍橙典型性風味。