人常乳與牛常乳中全譜游離氨基酸和水解氨基酸的對比

關博元，張正翰，石佳鑫，時 旭，岳喜慶*，楊 梅*

（沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110866）

乳是雌性哺乳動物分娩后從乳腺分泌的一種生物流體，含有多種功能性生物活性成分，如細胞因子、生長因子、核苷酸以及蛋白質等，在機體免疫、生長發育以及腸道微生物群落調節中發揮重要作用[1-2]。在母體分娩15 d以后所分泌的乳稱為常乳，常乳分泌時間長，對哺乳嬰幼兒十分重要。牛乳含有人體生長發育以及維持機體健康所需的氨基酸、礦物質、維生素以及乳蛋白和乳脂肪等營養物質，被認為是人類的理想天然食品之一[3]。

雖然牛乳的營養成分組成與人乳相近而被作為人乳替代品首選，但是牛乳和人乳的物質組成上仍然存在質與量的差異，人常乳中乳清蛋白與酪蛋白的比例為60∶40，而牛常乳中乳清蛋白與酪蛋白比例為20∶80，雖然牛乳中酪蛋白比重高于人乳，但是實驗證明人乳具有高成分β-酪蛋白和低成分αS1-酪蛋白，較牛乳更為營養[4-5]。人常乳中的免疫球蛋白A、乳鐵蛋白和溶菌酶占總蛋白的30%，高于牛常乳，能夠有效抑制嬰幼兒腸道中病原微生物的生長繁殖[6]。人乳中脂肪含量與牛乳相近，但是人乳中不飽和脂肪酸結構較牛乳更加合理，容易被嬰幼兒消化吸收[7]。研究表明人乳較牛乳含有更高比例的復合低聚糖，具有免疫調節以及促進嬰幼兒結腸成熟的功能[8-9]。母乳可為新生兒健康提供營養、補充腸道益生菌，但是存在無法母乳喂養的情況，所以有必要開發一種嬰幼兒配方乳品，以最佳的方式模擬人乳。雖然牛初乳中營養價值高且富含免疫因子，但是物理性質不如牛常乳穩定，不適合用于嬰幼兒配方乳品的生產加工，因此通過對比牛常乳與人常乳的生物活性物質，開發更適宜嬰幼兒食用的配方乳品具有重要意義[10-11]。

由于人體攝取乳中蛋白質的營養取決于其中所含有的各氨基酸之間的比例情況，各氨基酸比例是否合理是嬰幼兒能否獲取營養的關鍵指標，因此人體對蛋白質的需求實際上就是對氨基酸的需要[12-13]。部分學者在人乳或牛乳中只檢測到部分氨基酸[14-17]，并且也僅對牛乳和人 乳之間部分氨基酸 進行對比研究[18-19]，Liang Xiaona等[20]對人初乳和牛初乳中全譜游離氨基酸和水解氨基酸的種類及含量進行對比分析，研究發現雖然牛初乳中水解氨基酸總量高于人初乳，但是人初乳中游離氨基酸總量高于牛初乳且種類更齊全，該實驗僅對人乳和牛乳的初乳階段進行全譜游離氨基酸和水解氨基酸的種類及含量對比分析。因此為繼續完善不同泌乳時期人乳和牛乳中氨基酸的組成與含量差異研究，本實驗以人常乳和牛常乳為原料，對42 種全譜氨基酸進行分析，采用實驗自動化程度、靈敏度更高的同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）結合高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）技術[21]，測定乳中全譜游離氨基酸和全譜水解氨基酸，對人常乳和牛常乳之間的氨基酸組成含量進行對比研究，為配方乳品以及功能性食品的研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人常乳：實驗采集自沈陽市某醫院正常分娩、身體狀況良好、頭胎、飲食正常、年齡26～35 歲，產后30～40 d的產婦15 人，上午10點收集乳樣，將其放入已消毒的采樣瓶中，低溫運回實驗室，實驗前進行混合（防止個體差異）。除當天用乳樣放入4 ℃冰箱保存外，其余乳樣均置于－80 ℃冰柜冷藏，乳樣由授乳母親自愿提供。

牛常乳：實驗采集自沈陽市富強奶牛養殖場，選取年齡1～5 歲，體質量在700 kg左右，泌乳日齡30～40 d的健康荷斯坦奶牛15 頭，上午10點收集乳樣，將其放入已消毒的采樣瓶中，低溫運回實驗室，實驗前進行混合（防止個體差異）。除當天用乳樣放入4 ℃冰箱保存外，其余乳樣均置于－80 ℃冰柜冷藏。

甲酸、乙腈（均為色譜純） 美國Fisher公司；iTRAQ?試劑盒（10%磺基水楊溶液（含有400 pmol/μL的正異亮氨酸）、標記緩沖液（含有20 pmol/μL的正纈氨酸）） 美國應用生物系統公司。

1.2 儀器與設備

U3000液相色譜系統 美國戴安公司；API3200 QTrap質譜系統 美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品衍生化處理

移取80 μL乳樣于1 mL離心管中，向離心管中加入100 μL 10%磺基水楊酸溶液（含有400 pmol/μL正異亮氨酸），渦旋振蕩35 s后8 000 r/min離心5 min，吸取20 μL上層液體于另一1 mL離心管中，邊渦旋邊向離心管中加入50 μL標記緩沖液（含有20 pmol/μL正纈氨酸），繼續渦旋15～20 s后8 000 r/min離心4 min。移取20 μL上層液體置于另一1 mL離心管。每個離心管中分別加入10 μL稀釋的iTRAQ試劑后充分混勻。室溫條件下靜置孵化30 min后加入10 μL羥胺，渦旋振蕩混勻后8 000 r/min離心5 min。加入40 μL內標物渦旋混勻后，8 000 r/min離心5 min，上樣待測。

1.3.2 衍生化樣品HPLC-MS/MS檢測條件

H P L C條件：色譜柱為M S L a b H P-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；進樣量3 μL；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈-0.1%甲酸；流速0.8 mL/min；柱溫50 ℃。梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

MS條件：電子電離源，正離子電離方式；多反應監測掃描；碰撞氣為Medium；電噴霧電壓5 500 V；霧化溫度500 ℃；霧化氣壓力55 psi；輔助氣壓力60 psi；去簇電壓35 V；射入電壓10 V；碰撞能量30 eV；碰撞室射出電壓5 V；氣簾氣壓30 psi。

1.3.3 樣品酸水解處理及檢測

取5 mL乳樣于水解管中，加入5 mL濃鹽酸混勻后，用氮氣吹掃瓶內幾秒鐘后迅速密封，置于120 ℃水解23 h左右，然后取出水解液，4 000 r/min離心5 min后取上清液，用50 μL氮氣吹干后，加100 μL去離子水復溶，溶液待測。酸水解后樣品衍生化處理同1.3.1節。酸水解后衍生化樣品HPLC-MS/MS檢測條件同1.3.2節。

1.4 數據統計

使用SPSS 17.0程序對檢測得到的數據進行分析，使用Levene法對數據進行方差齊性分析。本研究測定的氨基酸質量濃度數據以 ±s表示，采用t檢驗進行數據顯著性分析，根據P值判斷差異性。

2 結果與分析

2.1 游離氨基酸種 類的鑒定結果

如圖1所示，12 min內得到42 種全譜氨基酸和2 種質控氨基酸即正異亮氨酸（Nle）和正纈氨酸（Nva）的總離子流圖。2 種質控氨基酸為非人體內氨基酸，在樣品預處理步驟中引入400 pmol/μL Nle，Nle回收后濃度為399.7 pmol/μL，通過Nle回收率校準各氨基酸的檢測結果。在衍生化標記步驟中引入20 pmol/μL Nva，Nva回收后濃度為15.97 pmol/μL，Nva用于檢測標記反應的效率，反應效率在80%～120%為合格[22]。圖1中各離子之間分離清晰，且2 種質控氨基酸回收率并無統計學差異，說明該方法可以檢測樣品中各氨基酸的含量。

圖1 44 種氨基酸的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of 44 amino acids

2.2 人常乳與牛常乳中游離氨基酸的對比分析

2.2.1 游離必需氨基酸的對比分析

表2 人常乳與牛常乳中游離必需氨基酸檢測結果Table 2 Contents of free essential amino acids in human and bovine miillkkss

由表2可知，人常乳中9 種必需氨基酸質量濃度顯著高于牛常乳（P＜0.05），人常乳中His質量濃度約是牛常乳17 倍，His能夠緩解由于高脂肪飲食引起的肝損傷[23]。人常 乳中的Leu、Met、Phe以及Thr質量濃度顯著高于牛常乳（P＜0.05），其中Met在人體中缺少可能會誘導多發性硬化癥，對中樞神經系統中的組蛋白H3以及DNA的甲基化具有潛在影響[24]；Phe可用來合成神經遞質和激素參與機體的糖代謝和脂肪代謝[25]；Thr與Fe結合的Thr-Fe螯合物具有緩解和改善缺鐵性貧血的功能[26]，通過牛常乳和人常乳中必需氨基酸質量濃度的差異，有助于深入了解人乳和牛乳。

2.2.2 游離非必需氨基酸的對比分析

由表3可知，人常乳中含有11 種非必需氨基酸，而牛常乳中含有7 種非必需氨基酸，人常乳中的非必需氨基酸與牛常乳相比種類更齊全。人常乳中Glu質量濃度最高，這與Ping Feng等[14]測定結果一致。人常乳與牛常乳間非必需氨基酸質量濃度均存在顯著性差異（P＜0.05），除Gln外，人常乳中非必需氨基酸質量濃度均高于牛常乳。人常乳中Ser質量濃度約是牛常乳27 倍，據研究表明L-PSer在機體中通過多種生化和分子機制起到神經保護的作用，具有治療神經系統疾病的潛力[27-28]。牛常乳中均不含有Asn、Asp、Cys以及Pro，Asn具有維持人體內細胞增殖以及蛋白質合成的作用[29]；Asp能夠促進三羧酸循環，同時也與鳥氨酸循環密切相關[30]；L-PCys可為人體補充巰基，維持皮膚的代謝[31]；L-Pro與抗壞血酸2種物質會影響DNA甲基化、轉錄以及能量代謝[32]，人常乳較牛常乳所具有的 營養特性可能與這4 種非必需氨基酸有關。

表3 人常乳與牛常乳中游離非必需氨基酸檢測結果Table 3 Contents of free non-essential amino acids in human and bovine miillkkss

表4 人常乳與牛常乳中游離非蛋白質編碼氨基酸檢測結果Table 4 Contents of free non-protein amino acids in human and bovine miillkkss

如表4所示，人常乳與牛常乳均含有15 種非蛋白質編碼氨基酸，Cth、Hcy、Car、Hyl、Sar、Asa和Hcit均未在人常乳與牛常乳中檢出，人常乳與牛常乳除GABA和Ans質量濃度差異不顯著外（P＞0.05），其他氨基酸質量濃度均存在顯著性差異（P＜0.05）。在人常乳中Tau、Cit、Abu、Ans、1-MHis、3-MHis以及PSer質量濃度高于牛常乳，其中1-MHis是參與神經之間信號傳導的神經遞質[33]，Cit具有調節血壓和抗氧化活性[34]，因此非蛋白質編碼氨基酸可作為營養補充劑提升功能性乳制品的品質。

2.3 人常乳與牛常乳中水解氨基酸的對比分析

2.3.1 水解必需氨基酸的對比分析

表5 人常乳與牛常乳中水解必需氨基酸檢測結果Table 5 Contents of hydrolytic essential amino acids in human and bovine miillkkss

從表5可知，人常乳和牛常乳除Trp外，均含有8 種必需氨基酸，且質量濃度均存在顯著性差異（P＜0.05），同時牛常乳中8 種必需氨基酸質量濃度明顯高于人常乳，在人常乳必需氨基酸中質量濃度最高的是Leu，與Ding Ming等[35]測定結果一致，Leu能夠激活人體中雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），激活后的mTOR可調節人體細胞的生長和分裂并且促進蛋白質的合成[36-37]，根據人常乳和牛常乳氨基酸的組成差異，可進一步提升以牛乳為基礎的嬰幼兒配方乳品中氨基酸的生物學效價。

2.3.2 水解非必需氨基酸的對比分析

如表6所示，人常乳和牛常乳除Asn外，均含有10 種非必需氨基酸，人常乳與牛常乳中Asp和Cys質量濃度差異不顯著（P＞0.05），牛常乳中其他8 種非必需氨基酸質量濃度顯著高于人常乳（P＜0.05）。在人常乳非必需氨基酸中質量濃度最高的是Glu，近期研究表明Glu具有調節食欲的作用，Glu衍生物能夠預防代謝紊亂、心血管疾病等[38]，通過對牛常乳的水解可進一步挖掘其中潛在的營養價值，為功能性乳制品的研究提供理論依據。

表6 人常乳與牛常乳中水解非必需氨基酸檢測結果Table 6 Contents of hydrolytic non-essential amino acids in human and bovine milks

2.3.3 水解非蛋白質編碼氨基酸的對比分析

表7 人常乳與牛常乳中水解非蛋白質編碼氨基酸檢測結果Table 7 Contents of hydrolytic non-protein amino acids in human and bovine miillkkss

從表7可知，人常乳和牛常乳均不含有Cth、Hcy、Car、Hyl、Hyp、3-MHis、PEtN、PSer、Asa和Hcit，在人常乳和牛常乳中GABA、Tau、Abu、Ans、β-Ala、β-Aib以及Etn質量濃度存在顯著性差異（P＜0.05），其中人常乳Tau質量濃度顯著高于牛常乳（P＜0.05），其余5 種非蛋白質編碼氨基酸質量濃度無顯著性差異（P＞0.05）。在人常乳非蛋白質編碼氨基酸中，Tau是人體各組織中含量最多的氨基酸之一，被稱為是“半必需氨基酸”，具有多效性功能，包括調節人體內滲透壓、保持細胞膜穩定性、細胞內鈣代謝以及神經元活性，有益于嬰幼兒的生長發育[39-40]，通過人常乳和牛常乳非蛋白質編碼氨基酸質量濃度差異，可為嬰兒氨基酸補充的可能策略提供依據。

3 結 論

本實驗采用iTRAQ與HPLC-MS/MS相結合的技術對人常乳和牛常乳中42 種全譜氨基酸進行測定，并對人常乳和牛常乳全譜游離氨基酸和水解氨基酸進行定性和定量分析，比較人常乳和牛常乳中氨基酸質量濃度差異。結果表明，在全譜游離氨基酸中，人常乳有7 種未被檢出，而牛常乳有11 種未被檢出，人常乳中游離氨基酸總量為0.37 g/L，約是牛常乳（0.16 g/L）的2 倍，可以看出人常乳中含有的氨基酸種類更齊全；在全譜水解氨基酸中，人常乳和牛常乳均有12 種未被檢出，人常乳中水解氨基酸總量為2.5 g/L，牛常乳中水解氨基酸總量為3.3 g/L。在人常乳的游離氨基酸和水解氨基酸中，Glu質量濃度最高。將人常乳和牛常乳中全譜游離氨基酸和水解氨基酸測定結果進行對比分析，發現人常乳、牛常乳中水解氨基酸Trp、Gln、Tau等質量濃度均低于游離氨基酸，這主要是由于酸水解處理對氨基酸中吲哚環有破壞作用，從而造成氨基酸含量的損失；除Trp、Asn和Cys外，牛常乳中水解必需和非必需氨基酸質量濃度均高于人常乳，這與游離氨基酸的部分測定結果截然相反，由此說明牛常乳中氨基酸主要以蛋白質的形式存在。本實驗通過對人常乳和牛常乳中全譜游離氨基酸和水解氨基酸差異分析，為未來配方乳制品以及功能性食品的發展提供研究參考依據。