鱘魚傳統發酵過程中揮發性風味物質的分析評價

趙 鳳，許 萍，曾詩雨，楊 興,*

（1.貴州省農業科學院水產研究所，貴州 貴陽 550025；2.通標標準技術服務（上海）有限公司農產食品部，上海 200030）

發酵酸魚是貴州侗族的傳統美食之一，其腌制方式獨特，味道香美[1]，深受當地居民的喜愛，也是招待客人的美味佳肴，具有豐富的飲食文化內涵[2]。其制作方式簡單，只需將魚肉放在干凈的容器內魚與糯米粉交替平鋪，然后在適宜的溫度下進行密封發酵。鱘魚是貴州山區的特色冷水魚，目前主要以鮮活銷售為主，為填補鱘魚加工市場的空白，需開發一種發酵鱘魚產品。

揮發性風味物質種類較多，包括酸類、醇類、醛類、酯類、酮類、芳香烴、酚類等，其中酸、醇、酯、酮、醛具有較低的閾值，對風味的形成具有重要作用，因此檢測食品中的揮發性風味物質非常重要，尤其是對發酵產品等氣味顯著的食品。

固相微萃?。╯olid phase micro-extraction，SPME）的主要特點是樣品需求量少、溶劑消耗少、靈敏度高、重復性和線性好，而且還可以將采樣、萃取、濃縮、進樣集為一體，操作簡單快捷，結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用可以萃取和分析鑒定很多種揮發性風味物質[3]。目前水產品中揮發性風味物質的主要研究方法是SPME-GC-MS技術[4-8]，主要方法是利用SPME萃取樣品中的揮發性物質，然后GC-MS進行分離和鑒定。近年來一些學者對各種腌魚的風味進行研究[9-11]，但是關于發酵魚肉的風味研究很少，如李春萍[12]研究臭鱖魚發酵過程中的風味物質，發現醇類含量最高，而丁酸、三甲胺和芳樟醇對風味貢獻較大，管娟[13]研究固態發酵鰳魚，發現接種清酒乳桿菌發酵時揮發性羰基類以及醇類、酸類化合物的種類和含量明顯增加。本實驗以鱘魚為原料，采用傳統的發酵工藝，利用SPME-GC-MS方法分析從原料到發酵成熟過程中鱘魚肉中的揮發性風味物質種類和含量的變化，探討發酵鱘魚風味形成的過程，旨在研究整個發酵過程鱘魚的風味品質，以期為鱘魚的綜合加工利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱘魚由惠眾漁業有限公司惠水養殖基地提供。

氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸鹽（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；亞油酸標準品 德國CNW科技公司。

1.2 儀器與設備

SPME裝置：手動進樣手柄、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取頭 美國Supelco公司；GC6890-MS5975 GC-MS儀、HP-5MS彈性毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

工藝流程：新鮮鱘魚→取肉→腌制→發酵→成品。

操作要點：取鮮活的鱘魚宰殺，去頭、尾、內臟，取肉瀝干，魚片切成每塊質量20～30 g，添加魚塊質量3%食鹽和各種香辛料（辣椒、花椒、姜等），攪拌均勻，在4 ℃腌制2 d，然后在50～60 ℃干燥3 h，干燥至水分質量分數約55%～60%，冷卻至室溫，在容器的底部鋪上部分糯米粉，然后魚與糯米粉交替平鋪，壓緊，頂部鋪上一層糯米粉后夯實，加蓋，封嚴，20～24 ℃發酵5～6 周，直至pH 4.1～4.4制得即食休閑風味發酵魚制品。

樣品采集：選擇新鮮、腌制、發酵5、10、20、25、35 d的鱘魚發酵樣品（編號分別為CX、CTA、CTB、TCC、CTD、CTE、CTF），每個時期取3 個平行作為重復，其中發酵階段取3 個不同位置作為3 個樣品。

1.3.2 SPME-GC-MS檢測

研究報道萃取時添加飽和NaCl溶液可以有效終止魚肉酶活性，降低揮發性風味成分的溶解度，促進揮發性化合物的揮發，從而提高萃取效率[14]。將各組樣品分別與0.18 g/mL的NaCl溶液按1∶1質量比混合，勻漿后稱取5 g樣品到頂空瓶中待測，平行測定3 次。

SPME條件：65 μm萃取頭250 ℃老化30 min后，插入樣品瓶中，距頂端4 mm左右，在35、45、60、80、95 ℃水浴溫度吸附40 min，然后插入GC進樣口中，250 ℃解吸5 min后，取出萃取頭，GC-MS分析檢測。

GC條件：HP-5MS彈性毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；不分流模式進樣；升溫程序：柱初溫40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升至160 ℃，而后以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min；進樣口溫度250 ℃；載氣（He）流量1.0 mL/min。

MS條件：傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質量掃描范圍m/z 35～450。

1.3.3 定性與定量分析

定性：利用系統自帶NIST 02和Wiley質譜數據庫分析，且僅當正反匹配度均大于800（最大值1 000）的化合物才予以報道[15-16]。具體以C7～C40的正構烷烴為標準品，通過和文獻中的保留指數比對計算標準品的保留指數，再結合數據庫的分析，最終對化合物進行定性。

定量：利用面積歸一化法計算各成分在樣品中揮發性成分的相對含量，峰面積積分由安捷倫工作站完成；每個樣品3 個重復，結果作方差分析，利用SPSS 21.0軟件分析處理[17]。

1.3.4 關鍵風味化合物的確定

采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）法[18]，選擇樣品中總體風味貢獻最大的組分定義ROAVstan=100，其他揮發性物質ROAV則按下式計算：

式中：Cri為揮發性物質的相對含量/%；Ti為相應物質感覺閾值/（μg/L）；Crstan為對總體風味貢獻最大組分的相對含量/%；Tstan為對應物質的感覺閾值/（μg/L）。

1.4 數據處理

利用Xcalibur軟件分析GC-MS數據；所有實驗數據通過Excel、SPSS 17.0分析處理。

2 結果與分析

2.1 不同發酵階段鱘魚中揮發性成分分析

采用SPME-GC-MS對各發酵階段鱘魚樣品的揮發性成分進行測定，得到不同發酵階段樣品的GC-MS總離子流圖，見圖1。將取得的色譜峰在NIST譜庫檢索以及參考文獻，確定鱘魚發酵過程中共鑒定出108 種揮發性風味物質，其中烴類、酯類、芳香類、酮類、醛類、酸類、酚類、醇類以及其他類分別為17、13、6、11、21、7、1、29 種和3 種。

圖1 不同發酵階段鱘魚揮發性成分總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of volatile compounds in fermented sturgeon meat sampled at different fermentation stages

由表1可得，不同發酵階段鱘魚肉的揮發性風味成分的種類以及相對含量的變化比較明顯。鮮魚、腌制、發酵5、10、20、25 d和35 d 7個階段的揮發性風味成分的種類分別為38、48、66、72、75、76 種和84 種；隨著發酵時間的延長，揮發性風味物質的種類由前期的38 種增至成熟時的84 種，酯類、酸類和酚類的相對含量增加最為明顯，由前期的未檢出到發酵成熟時相對含量已達到19.63%。發酵成熟時，醛類、醇類、烴類及酮類是發酵鱘魚的主要揮發性成分，說明發酵過程中這些物質的變化反應鱘魚發酵風味的形成過程。

2.2 鱘魚發酵過程中揮發性風味物質變化分析

2.2.1 醇類化合物

在鱘魚發酵過程中醇類化合物的種類由新鮮時的12 種增加至發酵成熟時的26 種，但是醇類化合物的相對含量逐漸降低。在新鮮魚肉中的主要醇類物質是2-辛炔醇和1-辛烯-3-醇，但在腌制后相對含量明顯下降且隨發酵時間的延長相對含量越來越低；腌制后的主要醇類物質是1-戊烯-3-醇和桉油醇，其中相對含量也是隨發酵時間的延長逐漸降低，但是桉油醇在新鮮魚肉中未 檢測出。己醇在發酵初期的相對含量最高，隨后逐漸降低，到發酵成熟時相對含量比在新鮮和腌制2個階段的相對含量都高。相對含量較高的桉油醇和芳樟醇僅發酵鱘魚中產生，主要原因是這2種物質不是水產品本身所含物質，而是添加香辛料進入魚體的，成為加工類魚制品的新風味成分[12]。同樣雪松醇和松油醇也有可能是通過添加劑進入魚體，成為發酵鱘魚的特有風味物質。2-丁醇僅在發酵成熟后檢測出。其中飽和醇類的閾值高，所以對風味的貢獻就小[19]。不飽和醇閾值低，有特殊的香氣[20]，對魚類風味的貢獻大。1-辛烯-3-醇在水產品中非常常見，本實驗中此物質在新鮮魚肉中的相對含量最大，但隨著發酵時間延長，相對含量明顯下降，它是亞油酸的氫過氧化物降解產物[21]，可產生蘑菇風味[22]，普遍存在于淡水魚及海水魚的揮發性物質中[23]，因其閾值低，故對鱘魚的風味形成貢獻很大。

2.2.2 烴類化合物

在鱘魚發酵過程中檢出的烴類化合物共17 種，各個階段均檢測到大量烴類化合物，相對含量較高，但飽和烴化合物閾值一般都很高，所以對鱘魚發酵產品的風味貢獻較小。2,6,10,14-四甲基十五烷能夠賦予食品清香和甜香[24]。十四烷、十五烷、十六烷、十七烷和十七烷可能是由高分子質量的非不飽和脂肪酸降解產生，發酵過程中相對含量逐漸降低可能是被進一步分解為小分子化合物。研究發現，C6～C19存在于魚類和甲殼動物類的揮發性風味物質中，但因其閾值高，對水產品的整體風味貢獻不大[25]。在整個發酵過程中檢測到多種萜烯類化合物，其在其他水產研究中也有相關報道[26-28]檢測到。在一定條件下，烴類化合物可形成醛、酮和醇類等風味物質[29]，所以對鱘魚風味的形成具有潛在作用。

2.2.3 酯類化合物

酸和醇可發生酯化反應形成酯類化合物[30]。在整個鱘魚發酵過程中，新鮮鱘魚和腌制階段未檢測到酯類物質，發酵成熟后累積了大量的酯類物質，酯類物質可賦予食品水果香味[31-32]，是促進鱘魚發酵風味形成的重要物質。在發酵成熟時，乙酸乙酯相對含量在酯類物質中最高，又因其閾值低，故對鱘魚發酵樣品的風味貢獻率較大，使得發酵鱘魚具有特殊的酯香味。

2.2.4 醛類化合物

醛類化合物主要是酶和微生物氧化脂類化合物形成的[33]，閾值低，因氣味加和作用，即使微量也會對產品的風味產生很大影響[34]，因此被認為是腌臘魚的主要特征風味物質。鱘魚發酵過程中共檢測到21 種醛類物質，隨著發酵時間的延長醛類化合物的種類增多。己醛濃度高時產生酸敗味，濃度低時則產生清香味和香草味[35]，是亞油酸的氧化產物[36]，在鱘魚發酵過程中其相對含量隨著發酵時間的延長逐漸降低，使得發酵成熟產品產生更好的香味。壬醛有柑橘的香味[37]，閾值低，在發酵過程中均檢測到壬醛的存在，是發酵鱘魚的關鍵性風味物質。2,4-庚二烯醛是魚類的腥味物質[11]，是生魚肉的特征揮發物質，隨著發酵的延長其相對含量逐漸降低，使得發酵鱘魚的腥味減弱。2,4-癸二烯醛具有油炸的脂香味，在新鮮和腌制過的鱘魚中被檢出[38]。苯甲醛有甜橙氣息[39]，在發酵過程中檢測到這種物質，因其閾值低，所以對風味的貢獻大。十二醛、十三醛、十四醛、十六醛、7-十六烯、9,17-十八碳二烯醛這些分子質量大的物質只在腌制和發酵的樣品中被檢出，在新鮮魚肉中未檢測到，說明這些物質對發酵鱘魚的特征風味有重要貢獻。

2.2.5 酮類化合物

酮類化合物具有特殊的香味，大多數呈現脂肪味和焦燃味，因其閾值高于其同分異構體的醛[40]，所以對魚肉風味的貢獻比醛類小。酮類化合物可增強魚肉的腥味，本實驗中新鮮和腌制的鱘魚酮類化合物在揮發性物質中的相對含量比發酵各個階段的相對含量都高，這就可解釋發酵成熟的鱘魚腥味很弱的原因。3,5-辛二烯-2-酮具有動物油脂味，普遍存在新鮮的魚中，所以在發酵樣品中未檢出。

2.2.6 酸類化合物

整個發酵過程中共檢測到7 種酸類物質。這些物質在新鮮和腌制后的魚肉中都未檢測到，只是在發酵過程中或者發酵結束才檢測到。有研究表明[41]，酸類物質一是由細菌利用氨基酸發酵形成，二是脂質氧化形成。所以本實驗中酸類的形成是在微生物的作用下發酵形成還是魚肉中脂質物質氧化形成還不確定，待進一步研究。

表1 不同發酵階段鱘魚揮發性風味物質成分的相對含量Table 1 Relative contents of volatile fl avor compounds in fermented sturgeon sampled at different fermentation times%

續表1%

續表1%

2.3 不同發酵階段鱘魚ROAV

表2 不同發酵階段鱘魚揮發性風味成分的ROAVTable 2 ROAVs of volatile compounds in fermented sturgeon sampled at different fermentation times

ROAV越大說明這種物質對樣品的總體風味貢獻也越大。一般認為ROAV不小于1的物質為樣品的關鍵風味化合物，ROAV大于等于0.1且小于1的組分對樣品的總體風味具有重要影響[42]。如表2所示，1-辛烯-3-醇、壬醛和癸醛是新鮮鱘魚和整個鱘魚發酵過程中的關鍵風味物質。苯乙醛和檸檬烯是發酵開始至成熟的關鍵風味化合物。新鮮鱘魚肉的主體風味物質為2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、壬醛、癸醛、己醛等；腌制后的鱘魚肉主體風味物質為壬醛、1-辛烯-3-醇、己醛、癸醛、檸檬烯等；發酵5 d鱘魚肉的主體風味物質為1-辛烯-3-醇、檸檬烯、壬醛、乙酸乙酯、庚醇等；發酵10 d鱘魚肉的主體風味物質為壬醛、1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯、檸檬烯、癸醛等；發酵20 d鱘魚肉的主體風味物質為壬醛、檸檬烯、1-辛烯-3-醇、癸醛、乙酸乙酯等；發酵25 d鱘魚肉的主體風味物質為壬醛、檸檬烯、1-辛烯-3-醇、乙酸乙酯、癸醛等；發酵35 d鱘魚肉的主體風味物質為乙酸乙酯、檸檬烯、壬醛、1-辛烯-3-醇、庚醇等?？梢钥闯銮捌诤秃笃诘年P鍵風味大致相同，與中期的關鍵性風味物質略有不同，其具體原因有待進一步研究。但蔡瑞康等[43]在研究大黃魚糟制過程中風味物質發現糟制前期關鍵風味物質是壬醛、辛醛和2,3-戊二酮；中期是乙酸乙酯、辛酸乙酯和苯甲醛；成熟時為乙酸乙酯和辛酸乙酯。這可能與發酵時選擇魚的種類有關。

3 結 論

采用SPME-GC-MS技術可更全面、準確地鑒定鱘魚整個發酵時期的揮發性風味物質，然后采用ROAV法分析發酵過程中各樣品的主體風味構成。結果表明主要關鍵風味物質由2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇和壬醛、己醛、乙酸乙酯組成。且前期和后期的關鍵風味大致相同，與中期的關鍵性風味物質略有不同。通過研究鱘魚發酵過程中風味物質種類和相對含量變化，可為風味的形成機理及品質控制提供參考依據，為提高鱘魚發酵的風味品質提供方向。