劉 偉,張 群,李志堅,卞建明,黃綠紅,朱向榮,單 楊,*
(1.湖南省農業科學院湖南省農產品加工研究所,湖南 長沙 410125;2.中南大學隆平分院,湖南 長沙 410125)
黃花菜(Hemerocallis fulva)又名金針菜,百合科多年生草本植物,其花蕾可食,是我國傳統的特色蔬菜之一[1-2]。黃花菜被稱為“四大素山珍”之一,色澤金黃,香味濃郁,味道鮮美,營養豐富,含有大量糖類、維生素、氨基酸、多酚、類胡蘿卜素、黃酮類等多種成分[3-7],具有抗氧化、抗菌消炎、抗抑郁、抗失眠、平肝養血、消腫利尿、鎮痛、通乳等功能[3,8-10]。我國黃花菜種植面積約4萬 公頃,其中主要分布在湖南、陜西、甘肅、山西4 個產區[2],品種有30 余種。年產鮮黃花菜56~80萬 t,加工干制黃花菜10~16萬 t,產值達100億 元以上。湖南省黃花菜種植面積和產量均居全國第一,以祁東縣為主,黃花菜已成為當地農村經濟的支柱產業。
游離氨基酸又稱非蛋白氨基酸[11],是人體VE、葉酸等營養素的良好來源[12]。游離氨基酸可被人體直接吸收,其含量和成分能反映食品的營養價值,可參與人體的新陳代謝、生長、免疫,同時作為重要的呈味物質體現出鮮、甜、酸、苦及澀等味感,這些多樣的味感形成了食物豐富的味覺層次[13]。食品中游離氨基酸的含量與種類是評價其食用品質的一項重要指標[14],而由于游離氨基酸種類較多,結構接近,大部分沒有紫外或熒光響應,分析較為困難,因此采用化學計量學多變量分析對其進行評價顯得尤為重要。目前,已有食用菌、花椒、桑葚、獼猴桃、貝、蝦等氨基酸種類及含量分析研究的報道[11,15-19]。陳惜燕等[15]發現對8 種食用菌呈味效果貢獻最大的是甘氨酸(Gly);甲殼綱動物中游離氨基酸的突出特點是含有大量的丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)及谷氨酸(Glu)[14];然而,目前黃花菜中游離氨基酸的含量和種類研究較少,對其開展分析研究在提高資源開發利用方面具有重要意義。
主成分分析(principal component analysis,PCA)能夠反映原始變量的大部分信息,且所含信息互不重復,具有更優越的性能[17,22-23]。目前此方法已被廣泛應用于農產品品質評價特征性指標篩選和品質綜合評價。李俊芳等[17]分析不同果桑品種游離氨基酸綜合質量的差異,通過PCA評價品質較優的品種;侯娜等[16]對13 個不同產地花椒種質的氨基酸進行分析,并通過系統聚類分析把多個花椒種質歸為3 類,簡化品質評價工作。本實驗分析湖南省主栽的10 個黃花菜地方特色品種的游離氨基酸,采用味道強度值(taste active value,TAV)、PCA法及聚類分析法對游離氨基酸品質指標進行分析和綜合評價,研究不同品種黃花菜游離氨基酸的組成和含量差異性,以期為黃花菜的營養與特征風味研究、品種篩選及產品的開發利用提供理論依據。
供試黃花菜為湖南黃花菜主產區邵東、祁東的主栽品種,分別為金中花(JZ)、早花(ZH)、海帶花(HD)、白花(BH)、猛子花(MZ)、駝駝花(TT)、沖天花(CT)、八月花(BY)、小八月(XBY)、四月花(SY)。
實驗所取樣品為新鮮黃花菜,于2017年5~7月采收。根據色澤和外形,選擇均一成熟度進行采收,一般為抽穗后大約27~35 d。所有樣品采摘后用保鮮袋分裝,再放入加有冰塊的泡沫紙箱,取回后保存于-80 ℃,待用。
氨基酸混合標準品、茚三酮 德國Menbar Pure公司;濃鹽酸、磺基水楊酸、氫氧化鈉等(均為分析純)國藥集團化學試劑有限公司。
J-26xp冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立高新技術公司;AL204電子天平、DELTA320 pH酸度計梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;XHF-D高速勻漿機寧波新芝生物科技有限公司;Research plus移液槍(100~1 000 μL) 德國艾本德公司。
1.3.1 樣品前處理
采用磺基水楊酸水解法預處理樣品,黃花菜勻漿后稱取1 g置于研缽中,加入質量分數4%磺基水楊酸溶液25 mL冷藏過夜,8 000 r/min離心15 min。取上清液過0.22 μm水系微孔濾膜上機待測。3 組平行實驗,測定結果取平均值。
1.3.2 標準品混合溶液的制備[23]
混合氨基酸標準儲備液(1 μmol/mL):分別準確稱取單個氨基酸標準品(精確至0.000 01 g)于同一50 mL燒杯中,用8.3 mL 6 mol/L鹽酸溶液溶解,精確轉移至250 mL容量瓶中,用水稀釋定容至刻度,混勻混合;氨基酸標準工作液(100 nmol/mL):準確吸取混合氨基酸標準儲備液1.0 mL于10 mL容量瓶中,加pH 2.2檸檬酸鈉緩沖溶液定容至刻度,混勻,為標準上機液。
1.3.3 氨基酸自動分析條件
分離柱為陽離子交換樹脂2619(4.6 mm×60 mm,3 μm),柱溫57 ℃,反應柱溫度135 ℃,檢測波長570、440 nm,緩沖溶液流速0.40 mL/min,茚三酮流速0.35 mL/min,進樣量20 μL。采用系統自帶軟件進行數據分析,對樣品圖譜進行積分后選定校正文件進行計算。
1.4.1 相關性分析
采用SPSS 18.0軟件進行相關系數分析,相關系數反映原始變量之間的線性相關程度。
1.4.2 TAV分析
TAV為呈味物質測定值與呈味物質味覺閾值的比值。數據分析采用Excel軟件完成。
1.4.3 PCA及綜合評價
采用SPSS 18.0軟件進行不同品種黃花菜游離氨基酸PCA,抽取特征值大于1.00的因子作為主成分。利用主成分對不同品種黃花菜進行綜合評價,將各主成分得分Fi和相應權重相乘后求和得到綜合評價函數[25-26]。
1.4.4 聚類分析
對10 個黃花菜品種采用系統聚類法進行聚類分析,數據分析采用SPSS 18.0軟件完成。
由表1可知,10 個品種黃花菜各含有14~17 種氨基酸,其中包括蘇氨酸(Thr)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)和苯丙氨酸(Phe)7 種必需氨基酸[17-18],1 種條件必需氨基酸酪氨酸(Tyr),2 種營養半必需氨基酸組氨酸(His)和精氨酸(Arg),天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)、胱氨酸(Cys)和脯氨酸(Pro)7 種非必需氨基酸。從表1可以看出,不同品種黃花菜中游離氨基酸的種類存在較明顯差異。其中HD、MZ、CT、BY和XBY含有的FAA種類最多,達17 種;JZ、ZH、TT和SY含有16 種,均不含有Met;而BH中最少,僅含13 種,未檢測出Cys、Met、His和Arg。

表1 不同品種黃花菜游離氨基酸組成Table 1 Free amino acids composition of different cultivars of daylily buds
不同黃花菜品種之間在游離氨基酸總量、人體必需氨基酸、呈味氨基酸及限制氨基酸的含量均存在較大差異。從總氨基酸含量來看,游離氨基酸變化范圍為10.47~17.244 mg/g,與楊利[27]、唐道邦等[28]的研究結果一致。其中CT中游離氨基酸總量最高,TT、BY和XBY含量相近,均高于15 mg/g,含量最低的是ZH。從必需氨基酸含量來看,變化范圍為4.434~7.191 mg/g,其中含量最高的是CT,占游離氨基酸總量的41.7%,含量最低的是HD。10 種黃花菜中所含呈味游離氨基酸總量以CT含量最高,為8.744 mg/g,占游離氨基酸總量的50.7%;ZH最低,只有5.291 mg/g;而對于限制游離氨基酸含量而言,最高的是CT,為1.463 mg/g,占游離氨基酸總量的8.48%,ZH最低,只有0.626 mg/g。在檢測的17 種氨基酸中,各種氨基酸按含量高低依次為Asp、Glu、Phe、Leu、Lys、Ala、Tyr、Val、Arg、Pro、Ile、Gly、Ser、Thr、His、Cys、Met。Asp在10 個品種中含量較高,平均值為1.794 mg/g;Met含量最低,平均值為0.024 mg/g。
各品種間,Met含量的變異系數最大,Tyr、His、Arg、Cys和Pro變異系數也較大,而Thr、Gly和Ala含量變異系數較小,表明黃花菜Met、Tyr、His、Arg、Cys和Pro的含量品種間差異較大,而Thr、Gly和Ala的含量品種間差異性相對較小。
新鮮黃花菜食用時口感清甜鮮美,與其所含的豐富游離氨基酸有關。Glu是所有呈味氨基酸中鮮味最強的氨基酸,作為食品調味行業中一種重要的鮮味劑,不僅具有較高的營養價值,同時具有預防治療肝昏迷及保護肝臟的功能[11,29];Gly、Ala是主要的甜味氨基酸,Gly有清香甜味,能有效降低苦味,去除食物中令人不快的口味[30]。依據氨基酸的呈味特征,大致將其分為鮮味氨基酸(Asp、Glu、Gly、Ala、Lys)、甜味氨基酸(Ser、Thr、His、Pro)、芳香族氨基酸(Cys、Tyr、Phe)、苦味氨基酸(Arg、Val、Met、Ile、Leu)[16]。
由表2可知,不同品種黃花菜中味覺氨基酸含量高低依次為:鮮味氨基酸>苦味氨基酸>芳香族氨基酸>甜味氨基酸。鮮味氨基酸含量變化范圍為4.038~7.536 mg/g,平均值為5.871 mg/g,占味覺氨基酸總量的42.13%,其中CT是含量最高的品種,達到7.536 mg/g,占味覺氨基酸含量的43.70%。甜味氨基酸含量變化范圍為1.563~2.74 mg/g,CT含量最高,占味覺氨基酸的15.89%;芳香族氨基酸含量變化范圍為1.484~3.032 mg/g,JZ芳香族氨基酸含量最高,達3.032 mg/g,占味覺氨基酸的22.41%;苦味氨基酸含量變化范圍為2.405~4.556 mg/g,CT含量最高,達4.556 mg/g,占味覺氨基酸總量的26.42%。不同品種黃花菜呈味氨基酸組成模式圖輪廓相似(圖1),貢獻較大的是鮮味氨基酸和苦味氨基酸,但CT的模式圖面積最大,說明在CT中3 種味覺氨基酸(鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸)含量普遍高于其他品種。黃花菜獨特的風味可能與高含量的味覺氨基酸有密切聯系,Glu、Asp、Ala、Gly等鮮味氨基酸占比較高,賦予新鮮黃花菜鮮美甘甜爽口的特點,同時有效減少苦味,緩解其中不良口感。

表2 不同品種黃花菜呈味氨基酸含量Table 2 Contents of taste-active amino acids in different cultivars of daylily bbuuddssmg/g

圖1 不同品種黃花菜呈味氨基酸組成模式圖Fig. 1 Comparative profiles of taste-active amino acids in different cultivars of daylily buds
各種游離氨基酸所具有不同的呈味特征與其閾值具有直接關系。根據各游離氨基酸閾值計算TAV,其值越大對樣品的呈味貢獻越大,反之亦然。當TAV大于1時,說明該呈味氨基酸對呈味有貢獻,而小于1時,該呈味氨基酸對呈味貢獻不大,呈味作用不顯著[11,24]。10 個不同品種黃花菜中氨基酸的TAV見表3。
由表3可知,在10 種黃花菜中TAV大于1的氨基酸組成基本相同,JZ、TT、CT、BY、XBY和SY最多,均有9 種氨基酸TAV大于1;ZH、HD和MZ次之,有8 種;BH中最少,僅6 種。其中呈鮮味的氨基酸種類最多,Asp、Glu、Ala和Lys 4 種TAV均大于1,對滋味的貢獻最大,其中Glu是最主要的呈鮮物質,對其風味具有重要的貢獻,具有形成黃花菜鮮味、緩沖酸與苦等味道的特殊功效。甜味也是黃花菜的主要特征味道之一,Gly、Ala等呈味氨基酸呈現舒適的甜味,10 種黃花菜中Ala和His的TAV大于1,對滋味貢獻很大。10 種黃花菜中苦味氨基酸種類最多,但黃花菜中先有苦味感,因僅有Arg和Val的TAV大于1,同時苦味氨基酸(如Phe、Tyr)含量低于呈味閾值時,可有效增強其他呈味氨基酸的呈味作用(鮮味和甜味)。以L型存在的天然Arg是一種苦味氨基酸,能增加呈味的復雜性和輔助提升鮮度,同時也是嬰兒生長發育必需的氨基酸,可有效降低血氨含量,促進肝昏迷的治療[11]。CT中大于味覺閾值的呈味氨基酸數量最多,Glu、Lys、His和Arg的TAV最大,分別為7.51、2.79、3.02和2.57,對鮮、酸味有較大貢獻,使該品種口感鮮美。SY中對其味道有特別貢獻的是Asp和Cys,其TAV分別為2.35和6.10,均高于其他品種。Asp是酸性氨基酸,帶有酸味,可直接作為酸味調節劑,同時也是一種鮮味劑,食品調味過程中可與呈味核苷酸等并用,可有效解除人體疲勞,在發達國家逐步代替味精的使用;Cys是生產肉味香精所必需的原材料,通過美拉德反應制備的肉味香精廣泛應用于醫藥和食品(如薯條、火腿腸等)等領域,具有預防和治療放射性傷害、皮膚美白、消除炎癥等功效。XBY中對其味道有特別貢獻的是Val,其TAV為2.35,均高于其他品種。TT中對其味道有特別貢獻的是Ala,其TA V為2.35,均高于其他品種。Ala具有甜味、鮮味,改善人工合成甜味劑的味感,可使甜度增效,減少用量。JZ中對其味道有特別貢獻的是Phe,其TAV為2.5,均高于其他品種。
總體來看,不同品種中17 種氨基酸的組成對其風味影響存在差異,整體表現為Thr、Ser、Gly、Met、Ile、Leu、Tyr和Pro對黃花菜的整體風味沒有貢獻,其余各氨基酸對黃花菜風味影響大小依次為Glu>Cys>Lys>Val>Phe>Asp>His>Arg>Ala>Ile>Leu>Gly>Ser>Tyr>Thr>Pro>Met。Glu對黃花菜風味的影響最大,TAV在3.53~7.51之間,平均值為5.66,屬于鮮味氨基酸,有效增加黃花菜的鮮美口味。

表3 不同品種黃花菜游離氨基酸TTAAVVTable 3 Taste activity values of free amino acids in different cultivars of daylily buds
對10 種黃花菜17 種氨基酸成分進行相關性分析,結果如表4所示。各氨基酸指標之間有正相關也有負相關,且多數相關系數的絕對值大于0.5,表明各游離氨基酸品質指標間具有較強相關性。Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Lys等氨基酸之間相關性達到較高水平。Glu與Asp、Thr、Ser、Gly、Ala、Val、Ile、Leu及Lys存在極顯著正相關,與Arg呈顯著正相關;Asp與Ser、Glu、Gly及Ala呈極顯著正相關,與Thr、Ile及Lys呈顯著正相關;Tyr與His、Arg呈顯著負相關;Cys與其他氨基酸均不存在顯著相關性。

表4 游離氨基酸指標間相關性分析Table 4 Correlation analysis of free amino acids in different cultivars of daylily buds
由表5可知,由于前3 個主成分對應特征值均大于1,累計方差貢獻率為89.242%,故可選取前3 個主成分。3 個相互獨立的綜合性變量,反映不同黃花菜品種游離氨基酸的大部分信息。
因子載荷值反映黃花菜各氨基酸指標對主成分載荷的相對大小和影響的方向,數值反映原變量對因子影響的大小,正負代表變化方向的差別。由表5、6可知,第1主成分中載荷較高的氨基酸指標有Thr、Lys、Gly、Val、Glu和Leu含量,載荷值均大于0.9,均為高度正相關,即第1主成分大時,Thr、Lys、Gly、Val、Glu和Leu含量越高,第1主成分公因子的方差貢獻率最大為56.643%,表明第1主成分對黃花菜風味品質的影響最大,稱為必需氨基酸因子。第2主成分中Met、Arg和His載荷較高且有正向影響,載荷值為0.863和0.860,載荷較高且有負向影響的指標為Tyr含量,載荷值為-0.815,第2主成分方差貢獻率為22.985%,稱為半必需氨基酸因子;第3主成分中Cys和Phe含量的載荷值較大,呈正相關,載荷值為0.885和0.717,方差貢獻率為9.614%,稱為營養氨基酸因子。

表5 總方差分解結果Table 5 Total variance explained

表6 主成分載荷矩陣Table 6 Principal component loading matrix of PCA
由圖2A可知,不同品種樣品的區分效果較好,10 個黃花菜的數據點均位于95%置信區間內,同時不同品種的樣品分別集中于圖的不同區域。為便于說明,將得分圖分為4 個象限。第1象限在PC1的負半軸、PC2的正半軸,分布于此象限的樣品在PC1得分值小于0,在PC2大于0;第2象限在PC1和PC2的正半軸,分布于此象限的樣品在PC1和PC2得分值都大于0;第3象限在PC1和PC2的負半軸,分布于此象限的樣品在PC1和PC2得分值都小于0;第4象限在PC1的正半軸、PC2的負半軸,分布于此象限的樣品在PC1得分值大于0,在PC2小于0。由圖2可以看出,不同品種的黃花菜分別位于不同的象限區域,其中BY、XBY和CT分布于第2象限,BY、XBY聚集較好,說明其含有的游離氨基酸成分組成和含量相近;MZ、HD和JZ分布于第1象限,MZ、HD聚集較好;BH位于第3象限,遠離其他品種,說明其游離氨基酸成分組成和含量差異較大;TT位于第4象限;SY和ZH位于PC2分隔線上,PC2得分值為0,說明其分布特征主要受主成分1影響。
由圖2B可知,CT和TT中Lys、Glu、Gly、Ser和Thr等氨基酸含量較高,故分布在PC1正方向;ZH中Cys和Tyr含量較高,故分布在PC1負方向;BH中Tyr和Pro含量較高,故分布在PC2負方向,說明正是這些氨基酸含量造成不同品種黃花菜樣品之間的差異。

圖2 不同品種黃花菜的PCA得分圖(A)和載荷圖(B)Fig. 2 PCA score plot (A) and loading plot (B) for different varieties of daylily
從表5可知,當提取3 個主成分時可解釋的累計方差達到89.242%,因此選用前3 個主成分已經足夠描述游離氨基酸的總體水平。以17 個游離氨基酸指標為初始自變量,經PCA,最終得出3 個主成分因子的方程表達式如下:

式中:F1為必需氨基酸因子,F2為半必需氨基酸因子,F3為營養氨基酸因子。這3 個主成分因子將原來17 個初始指標做正交變換組合成一組新的、彼此無相關性的綜合指標,基本涵蓋氨基酸指標的大部分信息。
3 個主成分分別從不同方面反映不同品種黃花菜游離氨基酸的總體水平,單獨使用1 個主成分并不能對不同品種游離氨基酸的質量作出綜合評價,因此以各主成分對應的方差相對貢獻率作為權重,對3 個主成分得分進行加權求和,由評價函數(F=0.635F1+0.258F2+0.108F3)計算各品種的綜合評價分值,總得分高低反映黃花菜游離氨基酸綜合質量高低。由表7可知,第1、2、3主成分得分最高的分別是TT、HD、CT,最低的分別是HD、BH、ZH。各品種黃花菜綜合品質從高至低的排序為CT、TT、BY、XBY、SY、JZ、BH、HD、MZ、ZH。10 個黃花菜品種中,CT的綜合評價得分最高為0.996,并且顯著高于其他品種說明其游離氨基酸綜合質量較高,ZH的綜合評價得分最低為-0.959,其綜合質量較低;JZ、ZH、HD、BH及MZ等綜合得分均為負,說明這5 個品種黃花菜中綜合質量水平低于平均水平。

表7 不同品種黃花菜的成分得分和綜合得分Table 7 Principal component scores and comprehensive scores of different cultivars of daylily buds

圖3 不同品種黃花菜聚類分析圖Fig. 3 Dendrogram from cluster analysis of different daylily cultivars
采用SPSS軟件對10 個黃花菜品種游離氨基酸品質進行系統聚類分析,數據采用不轉換方式,采用歐式距離和Ward linkage法,結果如圖3所示。10 個黃花菜品種用17 個游離氨基酸指標含量作為聚類變量。聚類結果表明:樣品可分成4 類:CT、BY、XBY和TT為第1類,氨基酸營養品質最高,Lys、Glu含量較高;SY和JZ為第2類,品質相對較好,Asp和Phe含量較高;BH為第3類,品質一般,Tyr和Pro含量較高;HD、MZ、ZH為第4類,品質相對較差。氨基酸品質的差異受到種植區域環境(土壤、氣溫)及栽培技術等因素的影響,該聚類結果與之前的PCA相比,得到同樣的分析結果,較好地反映出黃花菜不同種質間的差異性。因此,采用本實驗進行聚類分析是可行的,為地方特色黃花菜品種的引種推廣、開發利用及氨基酸營養價值評價提供良好參考。
黃花菜野生種繁多,具有繁殖容易、管理粗放、適應性和抗性強等特點,湖南在長期的栽培選育過程中形成豐富的品種資源優勢。為更好地開發利用黃花菜的野生資源,發揮其地方品種資源優勢,開展黃花菜游離氨基酸營養品質分析和綜合評價,篩選評價的關鍵指標,建立其綜合品質評價模型,為黃花菜品種選育及產品開發利用提供基礎數據和評價方法。
本研究對10 種黃花菜品種的游離氨基酸進行系統分析和評價。黃花菜中游離氨基酸含量豐富,含有14~17 種氨基酸,總量為13.935 mg/g,高于已報道的桑葚(0.387~2.701 mg/g)、芡實(0.98 mg/g)、克氏原螯蝦(4.784~8.835 mg/g)等農產品[11,17,31]。不同黃花菜品種之間氨基酸總量、人體必需氨基酸、呈味氨基酸及限制氨基酸的含量均存在較大差異。CT中游離氨基酸、必需氨基酸、呈味游離氨基酸及限制氨基酸的含量均最高。不同品種黃花菜中味覺氨基酸含量從高到低為鮮味氨基酸>苦味氨基酸>芳香族氨基酸>甜味氨基酸。其中CT鮮味、甜味及苦味氨基酸含量均最高。Glu對黃花菜風味的影響最大,TAV在3.53~7.51之間,平均值為5.66,屬于鮮味氨基酸,有效增加黃花菜的鮮美口味。
通過PCA從17 種游離氨基酸中提取到3 個主成分,分別是必需氨基酸因子、半必需氨基酸因子、營養氨基酸因子,其累計方差貢獻率為89.242%,較好地反映黃花菜游離氨基酸品質的綜合信息。建立綜合評價模型:F=0.635F1+0.258F2+0.108F3,計算得到不同品種黃花菜游離氨基酸綜合評價得分,得分越高表示該品種游離氨基酸的綜合質量越好。10 個品種得分從高到低分別為CT、TT、BY、XBY、SY、JZ、BH、HD、MZ、ZH,PCA能較為準確地評價10 個黃花菜品種中游離氨基酸綜合質量。采用聚類分析將10 個黃花菜品種分為4 類,該聚類結果與之前的PCA相比,得到同樣的分析結果,較好地反映黃花菜不同種質間的差異性,但是也有個別品種結果不一致,此差異可能受到種植區域環境(土壤、氣溫)及栽培技術等因素的影響。因此,根據黃花菜氨基酸含量開發利用不同黃花菜種質,加強其綜合利用。由于本實驗選擇的樣品產地僅局限于湖南省,并未包括我國所有黃花菜產地來源,因此在今后還需擴大采樣量和采樣范圍,詳細調查氣候條件和管理方式,設計實驗,明確環境因素對其氨基酸營養價值的影響,為黃花菜的營養與特征風味研究、品種篩選及產品的開發利用提供更多理論依據。