湖北優良茶樹品系綠茶香氣成分分析

馬林龍，劉艷麗，曹 丹，龔自明，劉盼盼，金孝芳*

（湖北省農業科學院果樹茶葉研究所，湖北 武漢 430064）

茶葉香氣是茶葉揮發性物質對人類嗅覺神經綜合作用的結果，一般只占干物質質量的0.01%～0.05%，是評價茶葉品質優劣的重要指標[1-2]。茶葉香氣形成的基礎是茶樹體內生物合成并積累的香氣前體物質，不同茶樹品種在香氣前體物質的含量、組成比例以及內含糖苷水解酶特性等方面存在較大差異，其制作的茶葉香氣類型也不同，因而形成各具特色的“品種香”[3-5]。隨著生活水平不斷提高，茶葉香氣品質越來越受到人們的關注，尤其在高香或特異香型茶樹種質資源開發利用上[6-7]。湖北是我國的產茶大省，但高香或特異香型茶樹品種卻非常稀少。近年來，茶葉科技工作者通過系統選育、雜交育種和分子育種等手段創制了一批表現優良的茶樹品系，但對其香氣相關研究卻較少。

本研究采用感官審評法和頂空固相微萃取法結合氣相色譜-質譜（head-space solid-phase micro-extraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）聯用技術，同時采用氣味活度值（odour activity value，OAV）、主成分分析（principal component analysis，PCA）法和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal projections to latent structure-discriminant analysis，OPLSDA）法，以國家優良茶樹品種福鼎大白茶為對照，對比分析湖北省6 個優良茶樹品系所制綠茶的香氣感官特征和主要香氣成分，系統了解各個茶樹品系所制綠茶的主要呈香物質和關鍵差異香氣成分，以期充分利用各品系的優良特性和生產性能，促進優良茶樹品系的推廣應用，同時為特異香型茶樹品種的選育研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

福鼎大白茶、03-7-4、03-7-1、20-2-1、07-7-68、07-7-64、01-4-7 7 個供試材料均采自湖北省茶樹種質資源圃。2013年將1 a生大小一致的6 個茶樹品系和對照組福鼎大白茶的茶苗栽植在四周空曠、地勢平坦、土壤結構良好、肥力中等一致的試驗田中，各品系種植實驗小區面積為13.5 m2，3 次重復，隨機排列。種植方式：大行距150 cm，小行距40 cm，株距20 cm，雙行雙株側窩種植，栽培管理措施一致。2017年3月份采摘各品系春梢一芽二葉，制作烘青綠茶茶樣。制作工藝流程：攤放→殺青→揉捻→初烘→攤涼→復烘→攤涼包裝[8]。

癸酸乙酯（純度99%） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

手動SPME進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭 美國Supeclo公司；7890A GC儀、5975C MS儀、HB-5MS（30m×0.32mm，0.25 μm）彈性石英毛細管柱 美國Agilent公司；HHS型恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；Milli-RO PLUS 30純水機法國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 感官審評

根據GB/T 23776—2009《茶葉感官審評方法》[9]中名優綠茶審評法，由3 名專業人員對樣品的香氣進行感官審評。

1.3.2 HS-SPME

準確稱取3.0 g茶樣放入萃取瓶中，加入90.0 mL沸水，加入2.00 μL的內標（90 mg/L癸酸乙酯），然后將裝有50/30 μm DVB/CAR/PDM萃取頭（使用前于250 ℃老化15 min）SPME手持器通過瓶蓋的橡皮墊插入到萃取瓶中，在50 ℃水浴中平衡10 min，吸附50 min后，取出并立即插入GC儀的進樣口中，解吸附3 min，同時啟動儀器收集數據。

1.3.3 GC-MS聯用分析

GC條件：HB-5MS（30 m×0.32 mm，0.25 μm）彈性石英毛細管柱，進樣口溫度240 ℃，載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min。

柱溫程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升至250 ℃保持3 min。

MS條件：電子電離能量為70 eV；質量掃描范圍為50～600 u；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；MS傳輸線溫度為280 ℃。

1.3.4 香氣成分的定量和OAV計算

利用NIST11.L譜庫比對得到的質譜圖進行串連檢索和人工解析，質譜匹配度大于90%作為物質鑒定標準。以癸酸乙酯作為內標物，每個香氣成分質量濃度按式（1）計算：

式中：Ci為某成分質量濃度/（μg/L）；Cis為內標質量濃度/（μg/L）；Ai為某個成分峰面積；Ais為內標峰面積。

OAV按公式（2）計算：

式中：Ci為某個成分質量濃度/（μg/L）；Ti為該成分的氣味閾值/（μg/L）。

1.4 數據分析

采用SPSS 17.0軟件進行方差、相關性分析；采用SIMCA-P 13軟件進行PCA和OPLS-DA。

2 結果與分析

2.1 不同茶樹品系綠茶香氣成分分析

由表1可知，釆用HS-SPME-GC-MS對6 個茶樹品系所制綠茶的香氣成分進行分析鑒定，共檢測到55 個主要香氣成分，其中41 個成分在所有樣本中均檢測出，為共性成分。6 個茶樹品系所制綠茶香氣總量在138.61～291.66 μg/L之間，均要顯著高于對照組，其中20-2-1的香氣總量最高，約為對照組2.5 倍。由表1可知，芳樟醇（14.53～41.74 μg/L）、壬醛（9.7 0～2 2.1 3 μ g/L）、 (Z)-己 酸 -3-己烯酯（3.05～66.31 μg/L）和香葉醇（5.30～24.18 μg/L）是所測樣品中質量濃度較高的香氣物質，其次是(E)-己-3-烯基丁酸酯、二甲硫、水楊酸甲酯、庚醛、癸醛等。已有研究表明，芳樟醇、壬醛、香葉醇、(Z)-己酸-3-己烯酯和二甲硫等物質在綠茶香氣中含量較高，是綠茶香氣的主要成分[10-12]。這與本實驗研究結果相符。

不同茶樹品種鮮葉制成的茶葉在香氣風格上存在較大差異，這種差異很大程度上是由于不同茶樹品種鮮葉的香氣前體物質的含量、組成比例等差異引起的[4,13]。6 個茶樹品系在主要香氣成分含量上存在較大的差異，如03-7-1中的芳樟醇質量濃度最高（41.74 μg/L）顯著高于對照組和其他品系；6 個茶樹品系中均有較高含量的壬醛，約為對照組的2 倍；(Z)-己酸-3-己烯酯對新茶香氣貢獻較大，在20-2-1中質量濃度高達66.31 μg/L，顯著高于其他品系，約是對照組的20 倍；香葉醇在20-2-1（24.18 μg/L）和07-7-68（23.88 μg/L）中均表現出較高質量濃度。(E)-己-3-烯基丁酸酯在20-2-1中質量濃度高達35.05 μg/L，而在福鼎大白茶、03-7-1、07-7-68中質量濃度僅為0.53、0.73、0.94 μg/L。新鮮綠茶特征性香氣成分二甲硫僅07-7-64略高于對照組，其他品系均不同程度低于對照組；6 個品系中水楊酸甲酯的含量均不同程度高于對照組；庚醛和癸醛在不同品系和對照組間雖有一定的差異，但差異幅度相對較小。其次，在含量相對較低的香氣組分中，不同的茶樹品系間同樣存在一定差異。如01-4-7中含有較高的吲哚，20-2-1和07-7-68中的δ-杜松烯質量濃度分別為11.36、9.77 μg/L，均顯著高于其他所測樣品。甲苯、α-柏木烯、β-紫羅蘭酮和香葉基丙酮在對照組中的含量要顯著高于6 個品系，而各品系間差異相對較小。α-蓽澄茄油烯在20-2-1中質量濃度為4.09 μg/L，而在對照組中未檢測出。01-4-7中未檢測到順-氧化芳樟醇，03-7-1中未檢測到葉醇；己酸甲酯僅在20-2-1中檢測到，質量濃度為0.69 μg/L，苯僅在03-7-1中有少量存在。

表1 不同茶樹品系綠茶香氣成分Table 1 Analysis of aroma contents in green teasμg/L

2.2 不同茶樹品系綠茶香氣化合物種類分析

圖1 不同茶樹品系綠茶香氣化合物類型及比例Fig. 1 Relative abundance of each class of aroma components in green teas

所測樣品中共檢出55 種香氣化合物，包括醛類16 種，醇類9 種，酯類8 種，烯類8 種，芳香烴類7 種，酮類5 種和其他類2 種。由圖1可知，醛類和醇類化合物所占比例較高，其次為酯類，三者占到所測樣品香氣成分的58.55%～80.81%。醇類化合物在03-7-1中所占比例最大，為45.02%，而在20-2-1中所占比例最低為17.82%；醇類化合物中以芳樟醇和香葉醇所占比例較大。所測樣品香氣中醛類化合物所占比例為15.98%～33.40%，醛類化合物中以玫瑰香氣的壬醛、水果香味的庚醛，香橙味的癸醛和蘋果香味的己醛含量較高。所測樣品中酯類化合物占香氣平均比例為20.45%，其中以具有水果青香的(Z)-己酸-3-己烯酯、水果芳香的(E)-己-3-烯基丁酸酯以及強烈的冬青油香氣水楊酸甲酯等酯類化合物為主，其中20-2-1酯類化合物占香氣比例高達45.98%，遠高于其他樣品。酮類、烯類、芳香類以及其他類化合物雖占香氣總量比例相對較小，但對綠茶香氣形成同樣有著關鍵作用[14-15]。烯類化合物主要以具有木香的δ-杜松烯、3-蒈烯和α-柏木烯為主；酮類化合物中的具有奶香的2,3-辛二酮，花香的β-紫羅蘭酮和清香的香葉基丙酮等含量較高，芳香類化合物則以甲苯和對二甲苯含量最高，這兩類化合物在6 個茶樹品系中含量明顯低于對照組；其他類化合物中的二甲硫是新鮮綠茶的一種重要的特征性香氣成分，所測樣品均含有較高的二甲硫。

2.3 不同茶樹品系綠茶香氣感官審評及相關性分析

表2 不同茶樹品系綠茶香氣感官審評結果Table 2 Sensory evaluation of green teas

由表2可知，所有樣品均具有鮮、清、高等典型的綠茶香氣特征，香氣感官品質得分在91.5～95之間，6 個品系香氣感官得分均要高于對照組福鼎大白茶。有研究表明，茶樹品種是決定茶葉香氣類型的主要因素之一，不同的茶樹品種即使栽培環境和加工工藝相同，在成茶香氣類型上也會存在非常明顯的差異[16-17]。由表1可知，01-4-7、20-2-1和03-7-1均帶有花香，香氣感官得分相對其他幾個品系要高。基于各樣品香氣組分含量（表1）與香氣感官得分（表2）結果，采用SPSS 17.0軟件進行相關性分析，結果表明，香氣組分中僅(E)-β-羅勒烯與感官得分有極顯著相關性（P＜0.01），相關系數為0.902，而與其他香氣組分均無顯著相關性。茶葉香氣是各個香氣組分綜合的結果，單個香氣組分很難全面反映茶葉香氣的總體特征，其次，僅以香氣物質質量濃度反映對茶葉香氣貢獻存在一定的局限性[18]。因此，這些因素的存在可能是導致香氣組分含量與香氣感官得分無顯著相關性的重要原因之一。

2.4 不同茶樹品系綠茶香氣成分的OAV分析

研究表明，香氣物質的氣味閾值對茶葉香氣有重要影響，OAV是綜合考慮香氣物質的含量和氣味閾值，避免僅以香氣物質含量反映其對香氣貢獻大小的誤區，是評價各化合物對樣品風味貢獻重要性的方法[19-21]，一般認為OAV大于1的成分可能對總體風味有直接影響[22]。基于不同茶樹品系所制綠茶香氣成分含量并通過文獻查找各香氣成分的氣味閾值[23-26]，對所測樣品進行OAV分析。由表3可知，所測樣品中共得到9 個OAV相對較高的香氣成分，依次芳樟醇、癸醛、二甲硫、β-紫羅蘭酮、香葉醇、壬醛、庚醛、(E)-2-壬烯醛、(Z)-己酸-3-己烯酯。所測樣品各個香氣成分OAV存在一定的差異，如芳樟醇在03-7-1中OAV最大，為69.56，顯著高于對照組；除07-7-64同對照組相當外，其余品系均不同程度高于對照組。含量相對較低的癸醛因氣味閾值較低，所有樣品均表現出較高的OAV，其中癸醛在07-7-64中的OAV高達87.09，可能是品系07-7-64中關鍵呈香物質，而含量較高壬醛因氣味閾值較大，均表現出較低OVA。β-紫羅蘭酮在福鼎大白茶中OAV高達37.40，明顯高于其他品系，可能是福鼎大白茶中關鍵呈香物質。(Z)-己酸-3-己烯酯在20-2-1中的OVA為6.63，明顯高于其他樣品，可能是20-2-1中的關鍵香氣物質。(E)-2-壬烯醛僅在03-7-4、20-2-1和07-7-64中的OAV大于1；香葉醇在03-7-1、20-2-1和07-7-68中的OVA依次為5.06、7.56和7.46，顯著高于其他樣品；二甲硫和庚醛在不同樣品中的OAV雖有一定的差異，但差異幅度相對較小。

表3 不同茶樹品系綠茶主要香氣化合物OAV分析Table 3 OAV of important aroma compounds in green teas

2.5 不同茶樹品系綠茶香氣成分的PCA和OPLS-DA

圖2 不同茶樹品系綠茶香氣成分PCAFig. 2 PCA derived from integrated GC-MS datasets for green teas

PCA和OPLS-DA通過對樣品數據的歸納、整理和統計分析，較為客觀地反映樣品的微小變化、分類以及變化趨勢等[27-28]。基于不同茶樹品系所制綠茶香氣成分的含量，利用SIMCA-P 13軟件進行PCA。由圖2可知，6 個茶樹品系均遠離對照組福鼎大白茶，說明6 個茶樹品系同對照組在香氣成分上存在較大的差異。同時，03-7-4、01-4-7、07-7-68和03-7-1 4 個品系聚為一類，說明這4 個茶樹品系所制綠茶香氣有一定的相似性。20-2-1和07-7-64分別單獨聚為一類，說明這2 個茶樹品系在所制綠茶的香氣上存在一定的特異性，20-2-1在香氣組成上含有較高的酯類化合物，且香氣總量最高；07-7-64在香氣組成上有高含量的醛類化合物。為進一步了解影響不同茶樹品系聚類的主要香氣成分，利用SIMCA-P 13軟件對茶樹品系綠茶香氣成分的含量進行OPLS-DA，從圖3A可知，不同茶樹品系的分類結果同PCA結果較為類似，進一步驗證PCA的結果。同時，一般認為OPLS-DA形成的載荷圖里的化合物越是接近起點對樣品聚類的影響越小[29]，由圖3B可知，(Z)-己酸-3-己烯酯、(E)-己-3-烯基丁酸酯、(Z)-3-甲基丁酸-3-己烯酯等酯類化合物對樣品分類具有較大的貢獻，而芳樟醇、二甲硫、壬醛等含量高的香氣物質反而對分類的影響較小。利用OPLS-DA形成的關鍵變量（variable inf l uence on projection，VIP）值的大小對不同茶樹品系所制綠茶香氣成分進行關鍵變量分析，一般認為VIP大于1為關鍵差異化合物[30]。由表4可知，共有19 種香氣成分的VIP值大于1，這些香氣物質對6 個茶樹品系分類具有較大的貢獻，這些關鍵化合物在不同茶樹品系以及對照組中的含量存在較大的差異，同時進一步驗證酯類化合物對樣品分類影響較大。

圖3 不同茶樹品系綠茶香氣成分OPLS-DA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig. 3 OPLS-DA score plot (A) and OPLS-DA loading plot (B) derivedfrom integrated GC-MS datasets for green teas

表4 不同茶樹品系綠茶香氣成分OPLS-DA的VIPTable 4 Compounds with VIP values of more than 1 as determined by OPLS-DA in green teas

3 結 論

以優良茶樹品種福鼎大白茶為對照，采用感官審評法和HS-SPME-GC-MS法對比分析湖北省6 個優良茶樹品系所制綠茶香氣感官特征和主要香氣成分。所測樣品均具有鮮、清、高等典型的綠茶香氣特征，香氣感官品質得分均高于對照組，其中01-4-7、20-2-1和03-7-1帶有花香，香氣感官得分相對較高。所測樣品共檢出55 個主要香氣成分，均以醛類和醇類化合物所占比例較高，其次為酯類，三者總共占到所測樣品香氣成分的58.55%～80.81%，而烯類、芳香烴類及其他類化合物所占香氣總量的比例較低。6 個茶樹品系綠茶香氣總量在138.61～291.66 μg/L之間，均要顯著高于對照組，其中20-2-1的香氣總量最高，約為對照組2.5 倍，可用于高香茶樹資源開發利用。芳樟醇、壬醛、(Z)-己酸-3-己烯酯和香葉醇是所測樣品中含量較高的香氣物質，其次是(E)-己-3-烯基丁酸酯、二甲硫、水楊酸甲酯、庚醛、癸醛等，但不同茶樹品系間存在較大的差異。其次，在含量相對較低的香氣組分中，不同的茶樹品系間同樣存在一定的差異。

通過對香氣成分進行OVA、PCA和OPLS-DA，系統了解各個茶樹品系所制綠茶的主要呈香物質和關鍵差異香氣成分。結果表明：共得到9 個OAV相對較高的香氣成分，依次芳樟醇、癸醛、二甲硫、β-紫羅蘭酮、香葉醇、壬醛、庚醛、(E)-2-壬烯醛、(Z)-己酸-3-己烯酯，這些物質對茶葉香氣形成有著重要的貢獻。PCA和OPLSDA表明，6 個茶樹品系與對照福鼎大白茶在香氣成分上存在較大的差異；03-7-4、01-4-7、07-7-68和03-7-1 4 個茶樹品系所制綠茶在香氣上有一定的相似性；20-2-1和07-7-64 2 個茶樹品系所制綠茶在香氣上存在一定的特異性，20-2-1在香氣組成上含有較高含量的酯類化合物且香氣總量高，07-7-64在香氣組成上有高含量的醛類化合物。利用OPLS-DA形成的VIP值對不同茶樹品系所制綠茶香氣成分進行關鍵變量分析表明，共有19 個化合物為區分所測樣品的關鍵差異香氣成分。